Арктик групп e1: Страница не найдена – Ошибка 404 – Группа ПОЛИМЕРТЕПЛО

«Сказочное свинство» и «Одна сатана»: 47 групп прошли отбор на «Старый Новый Рок»

Эксперты фестиваля «Старый Новый Рок» составили окончательный список участников, которые выступят 13 января в екатеринбургском «Ельцин Центре».
16:23 10.12.2018 ОТВ – Екатеринбург

«Адаптация Пчёл» и «Сказочное свинство»: на «Старом новом роке» выступят 47 групп с дикими именами

В Екатеринбурге споют рэперы, рокеры и даже эмо-панки Группа Magical Marginals из Екатеринбурга В Екатеринбурге 13 января пройдёт фестиваль «Старый новый рок».
14:56 10.12.2018 e1.Ru – Екатеринбург

Эксперты назвали участников «Старого Нового рока»

Экспертный совет фестиваля «Старый Новый рок» в Екатеринбурге выбрал 47 лучших групп, которые выступят 13 января в Ельцин Центре, сообщили организаторы.
14:01 10.12.2018 EaNews.Ru – Екатеринбург

Каменские музыканты выступят на «Старом новом роке»

Источник: Новый Каменск . Фото:   Каменская группа «Джек Штекер» примет участие в культовом фестивале «Старый новый рок».
12:50 10.12.2018 N-Kam.Ru – Каменск-Уральский

“Arctic Air” Wildfire (телевизионный эпизод 2013)

S2.E1

Все эпизоды

All

• Эпизод в эфире 9 января 2013

Ваши. РЕЙТИНГ

Бобби и Криста пытаются спасти группу застрявших туристов от бушующего лесного пожара, но им нужна помощь остальных членов экипажа Arctic Air, если они хотят выбраться живыми.Бобби и Криста пытаются спасти группа застрявших туристов от бушующего лесного пожара, но им нужна помощь остальной части экипажа Arctic Air, если они собираются выбраться живыми. Бобби и Криста пытаются спасти группу застрявших туристов от бушующего лесного пожара, но им нужна помощь остальных членов экипажа Arctic Air, если они хотят выбраться живыми.

IMDb RATING

7.2/10

17

YOUR RATING

• Director
  • Anthony Atkins
• Writers
  • Ian Weir
  • R.B. Carney
• Stars
  • Adam Beach
  • Pascale Hutton
  • Кевин МакНалти

• Режиссер
  • Энтони Аткинс
• Сценаристы
  • Ян Карни
  9. 9.000 РБ.0010
• Звезды
  • Adam Beach
  • Pascale Hutton
  • Kevin McNulty

Технические характеристики

• Средства выполнения

  1 час

Связанные новости

Внесение вклад в эту страницу

Предложите редактирование или добавление недостающего контента

Подробнее.

Почвенные бактериальные сообщества Арктики в окрестностях колонии гагарки

Введение

Высокоарктический архипелаг Шпицберген, где Шпицберген является крупнейшим островом, является местом размножения многих морских птиц, в том числе гагарки ( Alle alle ), который считается самым многочисленным видом морских птиц Палеарктики. Популяция люриков в Хорнсунде превышает один миллион особей и является одной из крупнейших колоний в мире (Isaksen, 1995). Птицы в большом количестве прилетают в этот район колонии в середине апреля и остаются там до конца августа (Stempniewicz, 2001). Морские птицы, которые кормятся в море и размножаются на суше, откладывают большое количество гуано, яичной скорлупы, перьев и туш вблизи своих колоний. Этот крупномасштабный перенос органических и неорганических веществ из моря на сушу имеет решающее значение для многих арктических и антарктических наземных экосистем (Stempniewicz et al., 2007; Zwolicki et al., 2015). Ранее было показано, что отложение гуано влияет на различные физико-химические параметры почвы и способствует формированию орнитогенных почв, тем самым способствуя развитию ассоциированных наземных растительных сообществ (Stempniewicz et al., 2007; Zwolicki et al., 2013; Wojciechowska et al. ., 2015). Было также показано, что обилие почвенных беспозвоночных, таких как ногохвостки ( Collembola ) или водяных медведей ( Tardigrada ), выше в районах орнитогенного обогащения почвы (Zawierucha et al. , 2015; Zmudczyñska-Skarbek et al., 2015b). Существует несколько исследований, указывающих на значительное влияние крупных колоний морских птиц на свойства почвы в арктических экосистемах, лишенных питательных веществ (например, Croll et al., 2005; Zwolicki et al., 2013, 2015; Skrzypek et al., 2015). . Точно так же отмечен вклад птиц в оплодотворение прибрежных вод вблизи колоний (Зеликман и Головкин, 19).72; Змудчиньска-Скарбек и др., 2015а). Тем не менее, до сих пор не сообщалось о влиянии удобрения почвы птицами на структуру и численность микроорганизмов в арктической среде. Поскольку гагарки могут оказывать существенное влияние на почвенную среду, можно ожидать разнообразия сообществ арктических почвенных бактерий в окрестностях этой колонии.

Из-за суровых условий окружающей среды ожидалось, что микробные сообщества в арктической почве будут состоять из относительно небольшого числа видов бактерий, но на самом деле они так же разнообразны, как и в других биомах (Neufeld and Mohn, 2005; Koyama et al. др., 2014). На разнообразие бактериальных сообществ арктических почв могут оказывать влияние различные природные факторы. Соседство с крупной гнездовой колонией планктоноядных морских птиц, люриков, по-видимому, оказывает существенное влияние на почвенную среду (Zwolicki et al., 2013). Сообщалось также, что орнитогенные почвы, возникшие в районах лежбищ пингвинов Адели в районе моря Росса Антарктиды, характеризуются более высокой микробной биомассой, чем минеральные почвы района моря Росса, где пингвины отсутствовали. Эти почвы также характеризуются более высоким содержанием органического углерода и более высоким содержанием общего азота и фосфора, высокой электропроводностью и большими колебаниями pH (Aislabie et al., 2009).). Сообщается также, что на острове Кинг-Джордж колонии морских птиц влияют на свойства почвы и растительность (Zwolicki et al., 2015). Таким образом, целью данного исследования было сравнение с использованием секвенирования следующего поколения (NGS) в анализе гена 16S рРНК бактериальных сообществ в образцах почвы, взятых из двух областей: (1) вблизи колонии морских птиц и ( 2) не подвергается влиянию морских птиц. Сравниваемые образцы были отобраны из топографически сходных мест. Поскольку бактериальные сообщества могут различаться из-за внешних факторов, влияющих на почвенную среду, таких как физико-химические условия, можно ожидать, что в каждом образце почвы будут разные бактериальные сообщества. Эти различия могут охватывать всю структуру сообщества или ограничиваться только одним присутствующим типом.

Материалы и методы

Район исследования и отбор проб

Образцы почвы были отобраны в северной части фьорда Хорнсунн (ЮЗ Шпицберген; 77° 0′ с.ш., 15° 33′ в.д.) в начале августа 2013 г. (рис. 1). Одна из проб (A)uk была собрана в районе влияния крупной гнездовой колонии планктоноядных люриков вниз по склону, на краю колонии. Эта колония располагалась на склоне горы Ариекаммен и насчитывала ок. 15 000 размножающихся пар (Puczko, Stempniewicz, 2013). Буйная растительность, с преобладанием Deschampsia alpina, Prasiola crispa, Cerastium arcticum и Chrysosplenium tetrandum покрывают ок. 95% этой хорошо удобренной площади (Zmudczyñska et al., 2012). Образец (C)control был собран в топографически аналогичном месте (около 550 м от образца A), но вдали от обычного маршрута полета морских птиц, поэтому орнитогенное воздействие было незначительным. Растительность в контрольной зоне имела гораздо меньшее общее покрытие (около 10%) и почти полностью была представлена ​​ Сообщество Sanionia uncinata-Salix polaris (Zmudczyñska et al., 2012). Оба образца были отобраны из верхних 15-20 см почвы, заморожены через 0,5 ч после отбора и хранились при -20°С до дальнейшего анализа.

Рисунок 1. Карты исследуемой территории . Справа: Расположение фьорда Хорнсунн на Шпицбергене. Слева: Крупный план северной части фьорда Хорнсунн с Ариекамменом и Фуглебергетом; черный квадрат – Польская полярная станция, черный овал в рамке – колония гагарок, черные точки – места отбора проб почвы: А – район в пределах колонии гагарок, С – контрольный район вдали от рутинного маршрута полета морских птиц.

Физический и химический анализ образцов почвы

Физико-химические характеристики почвы измерялись в соответствии с методикой, описанной Zwolicki et al. (2013). Оценивали сухую массу почвы (%), а также электропроводность почвы (мкСм см ^-1 ), рН и содержание азота (NO3- и Nh5+) и фосфата (PO43-).

Экстракция ДНК и амплификация бактериального гена 16S рРНК

После оттаивания ДНК экстрагировали из каждого образца почвы (экстракция проводилась в трех экземплярах для каждого образца) с использованием FastDNA 9Набор SPIN 0295® для почвы и инструмент FastPrep ^® (MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния). Во избежание перекрестного загрязнения образцов весь процесс выполнялся с использованием стерильного оборудования. Количество и качество выделенной ДНК оценивали с помощью спектрофотометра Nano Drop с последующим электрофорезом в агарозном геле. ДНК хранили при -20°C до дальнейшего использования.

Гипервариабельные области V3-V4 бактериального гена 16S рРНК амплифицировали с использованием следующей пары праймеров: 341F-CCTACGGGNGGCWGCAG и 785R-GAC TACHVGGGTATCTAATCC. Было показано, что целевые области генов наиболее подходят для секвенирования Illumina (Klindworth et al., 2013). Каждый образец был амплифицирован с помощью NEBNext 9.0295® High-Fidelity 2xPCR Master Mix (New England BioLabs) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование парных концов (PE, 2 × 250 нуклеотидов) выполняли с помощью Illumina MiSeq (MiSeq Reagent kit v2) компании Genomed (Варшава, Польша) и следуя протоколам производителя (Illumina, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). ).

Данные секвенирования и статистический анализ

Данные, полученные для 3 повторов экстракции ДНК для каждого образца почвы, были объединены и рассмотрены как один образец в дальнейшем таксономическом анализе. Цель этой процедуры состояла в том, чтобы получить более надежное представление о структуре бактериальных сообществ. Образцы были обработаны и проанализированы с использованием программного обеспечения Quantitative Insights Into Microbial Ecology (Qiime) v 1.8.0 (Caporaso et al. , 2010). Чтения с парными концами (PE) низкого качества были исключены из дальнейшего анализа, а чтения с фильтрацией по качеству были объединены на основе перекрытия чтения PE с использованием fastq-joint (Aronesty, 2011). Остальные последовательности, не соответствующие критериям качества, были удалены из дальнейшего анализа. Кластеризация операционных таксономических единиц (OTU) на 9Сходство 7% было выполнено с использованием метода uclust (Edgar, 2010). OTU были отнесены к таксонам с использованием GreenGenes v13_5 в качестве эталона (McDonald et al., 2012). Последовательности химер были обнаружены с использованием инструмента Chimera Slayer (Haas et al., 2011). После нормализации количества последовательностей был проведен статистический анализ состава бактерий и архей. Индексы разнообразия оценивались на основе кластеров, включающих индексы Chao1, Shannon и Simpson. Данные NGS депонированы и полностью доступны под следующими регистрационными номерами исследований: PRJEB9.513 и PRJEB9514 в ENA — Европейском архиве нуклеотидов.

Попарное сравнение двух образцов почвы A и C было выполнено с использованием метода SIMPER (процент сходства), основанного на показателе сходства Брея-Кертиса. SIMPER — это простой метод оценки того, какие типы в первую очередь ответственны за наблюдаемые различия между выборками (Clarke, 1993). Мера сходства Брея-Кертиса (умноженная на 100) обычно используется с SIMPER. Кроме того, сходство Брея-Кертиса является популярным индексом сходства, используемым для данных об изобилии (Bray and Curtis, 19).57). Общее среднее различие рассчитывалось с использованием всех типов, в то время как различия, характерные для типов, рассчитывались для каждого типа отдельно. Тест хи-квадрат был выполнен для изучения различий между образцами, и образцы сравнивались с учетом уровня типа. Все анализы проводились с использованием программного обеспечения PAST 3.0 (Hammer et al., 2001).

Результаты

Физические и химические характеристики почвы

Четкие различия в измеренной концентрации ионов и проводимости почвы, а также в сухой массе почвы можно увидеть между образцами A и C (таблица 1), как сообщалось ранее Зволицкий и др. (2013). Образец А показал гораздо более высокое содержание фосфатов (более чем в 12 раз) и нитратов (более чем в 7 раз) по сравнению с образцом С. рН образца А был ниже по сравнению с образцом С (6,51 и 6,74 соответственно).

Таблица 1. Значения содержания ионов в почве (мг/кг сухой массы почвы), pH, проводимости (мСм/см) и сухой массы (%) для образцов A и C .

Общее описание результатов секвенирования

Из образца почвы А, собранного в колонии люриков, мы получили 230 253 последовательности гена 16S рРНК хорошего качества (область V3-V4), а 279 122 последовательности гена были получены из контрольного образца С. , На уровне типа в случае обеих выборок мы смогли классифицировать более 99,97% всех полученных последовательностей. Подробный таксономический анализ разных рангов для обоих образцов почвы представлен на диаграммах солнечных лучей (Презентация 1) и в таблице (Дополнительная таблица 1). Для образца А было получено 3600 OTU, для образца C – 4844 OTU; оба протестированных образца имели 2822 общих OTU. Значение индекса Шеннона для образца А составило 8,92 и 9,31 для образца С, а значение индекса Чао1 составило 4391 и 5496 соответственно. Значение индекса Симпсона для обоих протестированных образцов составило 0,99. Индексы разнообразия представляют собой случайно выбранное подмножество для выборки, нормализованной до 229.,213 последовательностей. Анализ подобия образцов был проведен на относительно высоком таксономическом уровне в связи с тем, что мы не смогли идентифицировать микроорганизмы на более низких таксономических уровнях, а неклассифицированные микроорганизмы составляли даже до 80% общей доли сообщества. Кроме того, наша главная цель состояла в том, чтобы представить глобальный анализ и различия между двумя местами с различиями в характеристиках почвы. Попытка сравнить образцы на более низком филогенетическом уровне привела бы к фрагментарной картине, не обязательно отражающей глобальные различия в микробных сообществах.

Состав микробного сообщества

Анализ бактериальных сообществ, обнаруженных в образце почвы, собранном в колонии гагарки, показал, что 99,99% от общего числа прочтений были связаны с бактериями и 0,01% с археями (презентация 1). В контрольном образце почвы общее количество прочтений, представляющих бактерии , составило 99,96% и архей 0,04% (презентация 1). Таксономический анализ обоих образцов показал, что сообщества почвенных бактерий состоят из 34 типов, 32 из которых представлены в обоих образцах (презентация 1, дополнительная таблица 1). Образец А характеризовался отсутствием GN04 и Thermi phyla, а в образце С – 9.0263 Lentisphaerae и WS4 были обнаружены. Суммарная доля этих типов составляла менее 0,022% от общего числа сообществ для каждой тестируемой выборки.

Наиболее многочисленными типами, обнаруженными в образце А, были: Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria и Chlorofelxi (рис. 2, таблица 2). В совокупности эти типы составляют более 72,5% от общего количества полученных бактериальных последовательностей. Более того, 16 из этих типов отвечали за 99,5% всего бактериального сообщества. В образце C наиболее многочисленным типом было Актинобактерии . Другими типами со значительной долей были: Chloroflexi, Proteobacteria и Acidobacteria (рис. 2, таблица 2). На эти типы вместе приходится более 79% всех полученных бактериальных последовательностей. В этом случае 17 из этих типов отвечали за более чем 99,5% общей популяции бактерий. При сравнении обоих образцов образец C содержит почти в два раза больше Actinobacteria , чем образец A, тогда как для Chloroflexi , разница в численности между двумя образцами была незначительной. В случае Proteobacteria и Verrucomicrobia их более высокая численность в структуре бактериального сообщества связана с более низким рН почвы и более высоким распределением азота. Доля Actinobacteria и Proteobacteria была тем фактором, который в наибольшей степени способствовал различиям между выборками (табл. 2). Что касается доли каждого типа в общем бактериальном составе, то значимые различия между двумя выборками наблюдались только при сравнении доли Actinobacteria (χ ² = 8,91, df = 1, p = 0,004). Кроме того, в образце почвы, отобранном в птичьей колонии, наблюдались более низкие доли Proteobacteria и Acidobacteria , чем в контрольном образце, однако эти различия оказались статистически незначимыми (χ ² = 3,72, df ). = 1, p = 0,054 и χ ² = 0,60, df = 1, p = 0,44 соответственно). При одновременном рассмотрении всех типов мера расстояния Брея-Кертиса показала 78%-ное сходство между двумя выборками (A и C), а критерий хи-квадрат не показал статистически значимой разницы между выборками (χ ² = 13,09, df = 36, р = 1,0).

Рисунок 2. Изобилие последовательностей бактериального гена 16S рРНК на уровне типа . Анализ структуры микробного сообщества в образце почвы под влиянием колонии гагарок (А) и на участке, удаленном от маршрута рутинного перелета птиц, рассматриваемого как контрольный образец (В). «Другие» означают следующее: WS3, TM7, OP11, WS2, TM6, WPS-2, FBP, BRC1, WS4, BHI80-139, NKB19, Fibrobacteres , GN02, OP3, Spirochaetes, Chlamydiae, Lentisphaerae , PAUC34f, GN04, [Thermi] и неназначенные.

Таблица 2. Среднее различие между образцом A из колонии люриков и образцом C в качестве контрольного образца в сравнении с SIMPER-анализом, основанным на показателе сходства Брея-Кертиса на уровне типа .

На уровне классов две выборки значительно различались (χ ² = 191,64, df = 85, p < 0,0001). В образце А наиболее многочисленными бактериями были: Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Chloracidobacteria и Thermoleophilia . Напротив, Thermoleophilia, Actinobacteria, Alphaproteobacteria и Chloracidobacteria были наиболее доминирующими классами в образце C (презентация 1, дополнительная таблица 1). Betaproteobacteria составляют наибольшую долю в образце А, их доля составляет более 13%. Однако в контрольной выборке мы можем наблюдать, что их доля снижается и составляет всего 4,5% от общей численности населения. Кроме того, распространение Thermoleophilia и Actinobacteria , по-видимому, уменьшается в почвах с более низким pH и повышенной концентрацией ионов азота. На уровне класса только Alphaproteobacteria имеют одинаковую пропорцию среди наиболее распространенных бактерий в обоих протестированных образцах, несмотря на изменение pH и доступность азота. Дополнительный анализ критерия хи-квадрат, сравнивающий образцы A и C на уровне класса в пределах каждого типа отдельно, показал значительные различия между образцами для пяти типов: Actinobacteria, Armatimonadetes, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes и Proteobacteria (дополнительные таблицы 1, 2; рисунок 3).

Рисунок 3. Обилие последовательностей гена бактериальной 16S рРНК со значительными различиями между тестируемыми образцами на уровне класса . Тест хи-квадрат, выполненный на уровне класса для образца почвы А (внутри колонии гагарки) и для образца С (рассматриваемого как контрольный), указывает на значительную разницу между образцами среди следующих пяти типов: Actinobacteria, Armatimonadetes, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes и Proteobacteria .

Обсуждение

Гуано морских птиц является одним из трех основных источников азота в полярных наземных экосистемах, однако оплодотворение тундры морскими птицами неравномерно распределено во времени и пространстве вследствие неравномерного размещения колоний птиц и короткого периода их размножения. Как было показано ранее, отложение люриками богатого питательными веществами гуано существенно изменяет физико-химические параметры почвы в районе птичьего поселения (Zwolicki et al., 2013). Однако, несмотря на разительные различия в физико-химических характеристиках почв, а также различия в структуре растительности и обилии беспозвоночных (Wojciechowska et al., 2015; Zawierucha et al., 2015; Zmudczyñska-Skarbek et al., 2015b), мы не обнаружили существенных различия на филумном уровне таксономических рангов почвенных микробных сообществ в двух исследованных образцах. Сходство между этими двумя протестированными бактериальными сообществами составило 78%, кроме того, критерий хи-квадрат не показал статистически значимой разницы между протестированными образцами. Тем не менее, Actinobacteria и Proteobacteria были ответственны за различия между образцами, и дальнейший анализ с учетом каждого типа в отдельности показал, что существенные различия между протестированными образцами были обнаружены именно внутри типа Actinobacteria .

Высокое количество OTU, а также высокие значения индексов микробного разнообразия (индексы Шеннона и Симпсона) свидетельствуют о большом количестве видов в обоих протестированных образцах. Кроме того, большое количество OTU, наблюдаемое в обоих образцах, указывает на то, что оба почвенных микробных сообщества очень сложны. Анализ тенденций разрежения показал, что отбор проб бактериальных сообществ близок к завершению, что указывает на достаточную эффективность метода выделения ДНК (дополнительный рисунок 1). Кроме того, мы получили 2822 OTU, которые являются общими для обоих образцов, что указывает на высокое сходство между тестируемыми образцами. Однако существует и большая группа ОТЕ, специфичных для каждого конкретного образца почвы. Образец C характеризуется большим количеством OTU. Представляется, что более щелочные условия и низкое содержание питательных веществ в контрольной зоне соответствуют более разнообразному составу микробиома.

Поскольку образец А происходит из района, сильно подверженного влиянию морских птиц, можно ожидать, что он будет содержать менее разнообразные и, следовательно, более специализированные группы бактерий, чем контрольный образец (Koyama et al., 2014). Тем не менее, наиболее многочисленными типами в обоих протестированных образцах были: Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria и Chloroflexi , с различной долей в общей доле между образцами. Такое обилие и состав доли в бактериальных сообществах характерны для большинства исследованных к настоящему времени образцов почв различного происхождения (Janssen, 2006), в том числе и для арктической почвы (Chu et al., 2010). Также минорные группы структуры бактериального сообщества были аналогичны другим группам, описанным ранее для арктической почвы (Chu et al. , 2010; Kim et al., 2014). До недавнего времени предполагалось, что микробные сообщества в арктической почве будут иметь низкий уровень бактериальных видов, но на самом деле они характеризуются таким же уровнем разнообразия, как и другие биомы (Koyama et al., 2014). Более того, Чу и соавт. (2010) продемонстрировали, что бактериальные сообщества арктических почв характеризуются таким же уровнем изменчивости, богатства и филогенетического разнообразия, что и почвы, происходящие из широкого диапазона более низких широт. Это предполагает общую структуру разнообразия в сообществах почвенных бактерий по всему миру. Кроме того, структура бактериального сообщества арктической почвы связана с локальными факторами окружающей среды, особенно с кислотностью почвы, подобно тому, как это наблюдалось для состава грибного сообщества в этом высокоарктическом регионе (Zhang et al., 2016).

Ранее было показано, что рН почвы оказывает фундаментальное влияние на бактериальные сообщества (Shen et al. , 2013), поэтому отсутствие значимых различий между тестируемыми образцами более высоких таксономических рангов может быть следствием незначительного различия между значения рН почвы. Меньшие доли Proteobacteria и Acidobacteria , в большей степени ответственные за различия между двумя образцами (табл. 2), наблюдались в образце почвы под влиянием колонии птиц, характеризующейся более высокой кислотностью, тогда как доля Actinobacteria и Chlorofelxi был выше в более щелочных условиях, т. е. в контрольной зоне (рис. 2). По нашим наблюдениям, численность Proteobacteria была ниже в более щелочных условиях, хотя численность Alphaproteobacteria была одинаковой в обоих исследуемых образцах почвы. Мы также наблюдали большую диспропорцию вклада Betaproteobacteria в общую долю бактериальных сообществ в зависимости от разных значений рН почвы.

Ким и др. (2014) показали, что доля Alphaproteobacteria уменьшается с глубиной слоя почвы, в то время как другие исследователи продемонстрировали, что эти бактерии предпочитают среду, богатую питательными веществами (Nemerguta et al. , 2010) в результате дополнительного поступления азота (Fierer et al. ., 2012). Наш физико-химический анализ выявил значительно более высокую концентрацию азота в образце почвы из района птичьего поселения по сравнению с контрольным образцом, который также состоял из предыдущего анализа (Zwolicki et al., 2013), но, несмотря на это, доля Alphaproteobacteria изменились незначительно.

Некоторые бактерии из филы Actinobacteria способны эффективно фиксировать имеющийся в воздухе азот, и наличие такой функциональной группы бактерий в почве с постоянным дефицитом азота вполне объяснимо. Таким образом, эта группа может иметь большое значение в районе с постоянным недостатком питания и/или когда высокие нагрузки депонирования питательных веществ в районе птичьего поселения используются не полностью и смываются талым снегом на конец зимы (Skrzypek et al., 2015). Таким образом, снижение Обилие Actinobacteria в образцах почвы, подвергшихся воздействию птичьей колонии, кажется естественным в контексте большого количества отложений гуано и вследствие высокого содержания азота. Кояма и др. (2014) сообщили, что внесение удобрений снижает численность Actinobacteria в почве на уровне типов, в то время как Kim et al. (2014) показали, что численность Actinobacteria также может быть связана со значениями рН почвы. В представленном здесь исследовании мы наблюдаем, что в пределах доминирующих 9Тип 0263 Actinobacteria , классы Thermoleophilia и Actinobacteria более многочисленны при более высоких значениях pH почвы (рис. 3; дополнительная таблица 1), хотя численность всего типа ниже.

Уинсли и др. (2014) проанализировали 225 образцов почвы, охватывающих Арктику и Антарктику, на наличие преобладающих бактерий-кандидатов деления TM7. Эти типы были обнаружены почти в половине исследованных образцов, в пределах 0,05–2,23% от всего микробного сообщества. В нашем исследовании фила TM7 составляла 0,08% от общего микробного сообщества в образце из колонии и 0,15% в контрольном образце. Роль этих бактерий, как деления-кандидата, до сих пор неясна, поскольку они остаются некультивируемыми, однако они обычно обнаруживаются в образцах окружающей среды.

В данном исследовании, несмотря на различия в физико-химических характеристиках почв, существенных различий на филумном уровне сообществ бактериальной структуры между обоими исследуемыми образцами выявлено не было. Аналогичные результаты были продемонстрированы для района моря Росса в Антарктиде в случае орнитогенных почв, собранных с суши в пределах лежбищ пингвинов Адели (Aislabie et al., 2009). Эти результаты показали, что, несмотря на относительно высокие уровни питательных веществ и высокую микробную биомассу, бактериальные сообщества орнитогенных почв не более разнообразны, чем сообщества минеральных почв в районе моря Росса в Антарктиде. Несмотря на то, что исследование, представленное здесь и (Aislabie et al., 2009) были выполнены с использованием совершенно разных инструментов и анализов, и поэтому их нельзя сравнивать напрямую, они пришли к одному и тому же выводу, т. высокие таксономические ранги самой бактериальной структуры, хотя ограниченное число типов все еще может быть затронуто. Присутствие колонии люриков, которое влияло на pH почвы и распределение азота, повлияло только на несколько типов, таких как 9.0263 Актинобактерии и Протеобактерии . Дополнительный анализ, выполненный на уровне класса для каждого типа, показал значительные различия между образцами для пяти типов, , среди прочего, Proteobacteria. Хотя этот филум вместе с Actinobacteria в большей степени отвечал за различия между обоими протестированными образцами, мы смогли наблюдать лишь незначительные различия на уровне классов.

Подкисление почвы может оказать сильное воздействие на бактериальные сообщества арктической почвы, что определяется местными экологическими факторами (Chu et al., 2010). Наши результаты анализа высокого таксономического уровня показывают, что присутствие колонии гагарок, которая в целом влияла на физико-химические характеристики почвы (но в основном на распределение азота), влияет только на некоторые типы бактерий, например, Актинобактерии и Протеобактерии. Когда анализ проводился на уровне класса для каждого типа, значительные различия между образцами наблюдались для пяти типов: Actinobacteria, Armatimonadetes, Cyanobacteria, Gemmatimonadetes и Proteobacteria , где учитывались Armatimonadetes и Cyanobacteria . вместе составляют менее 1% от общей доли населения. Тем не менее, следует провести дополнительные анализы не только в отношении большего числа разрезов почвы и большего числа проверенных образцов из этой конкретной колонии, но и в отношении других колоний морских птиц.

Вклад автора

С.З. провел выделение ДНК, анализ данных секвенирования, написал рукопись, принял участие в планировании исследования и обсуждении; Д.К. выполнил статистический анализ данных, помог в написании рукописи и в сборе образцов; Л.С., М.Л. и Й.Л. помогали в написании рукописи и принимали участие в планировании исследования и дискуссиях.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была в значительной степени поддержана Национальным научным центром Польши (грант № 2011/01/D/NZ2/04817). Образцы были собраны в ходе проведения исследовательского проекта при поддержке Национального научного центра (грант № 2011/01/N/NZ8/04569). Мы благодарны Матеушу Барчиковски за участие в сборе образцов.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2016.01298

Презентация 1. Подробный таксономический анализ для разных рангов в двух протестированных образцах почвы . Диаграммы солнечных лучей показывают относительную распространенность последовательностей бактериального гена 16S рРНК для каждого образца почвы на разных таксономических уровнях. Первый уровень диаграммы солнечных лучей представляет все типы, присутствующие в конкретном образце; следующие уровни представляют класс, порядок, семейство и род соответственно (наиболее подходящим браузером является Firefox, данные в формате html доступны по следующей ссылке: https://www. dropbox.com/sh/u6x3dtmoohkkrja/AADQScCONd5lry6KX84JFuxua?dl= 0.

Дополнительный рисунок 1. Анализ разрежения испытанных образцов почвы на основе меры chao1 .

Дополнительная таблица 1. Подробный таксономический анализ различных рангов в протестированных образцах почвы . В таблице показано относительное количество последовательностей бактериального гена 16S рРНК для каждого протестированного образца почвы (A и C) на разных таксономических уровнях.

Дополнительная таблица 2. Различия между образцом А (под влиянием колонии гагарок) и образцом С (контрольный образец) на уровне класса внутри каждого типа в сравнении с анализом критерия хи-квадрат .

Ссылки

Айлаби Дж., Джордан С., Эйтон Дж., Классен Дж. Л., Баркер Г. М. и Тернер С. (2009). Бактериальное разнообразие, связанное с орнитогенной почвой региона моря Росса, Антарктида. Кан. Дж. Микробиол . 55, 21–36. doi: 10.1139/W08-126

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Аронести, Э. (2011). Инструменты командной строки для обработки данных биологического секвенирования . Дарем, Северная Каролина: Ea-utils.

Брей, Дж. Р., и Кертис, Дж. Т. (1957). Ориентация горных лесных сообществ южного Висконсина. Экол. моногр. 27, 325–349. doi: 10.2307/1942268

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Caporaso, J.G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F.D., Costello, E.K., et al. (2010). QIIME позволяет анализировать данные секвенирования с высокой пропускной способностью. Нац. Методы 7, 335–336. doi: 10.1038/nmeth.f.303

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чу, Х., Фиерер, Н., Лаубер, К.Л., Капорасо, Дж.Г., Найт, Р. и Гроган, П. (2010). Почвенное бактериальное разнообразие в Арктике принципиально не отличается от такового в других биомах. Окружающая среда. микробиол. 12, 2998–3006. doi: 10.1111/j.1462-2920.2010.02277.x

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Кларк, К. Р. (1993). Непараметрический многомерный анализ изменений в структуре сообщества. австр. Дж. Экол. 18, 117–143. дои: 10.1111/j.1442-9993.1993.tb00438.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Google Scholar

Кролл, Д. А., Марон, Дж. Л., Эстес, Дж. А., Даннер, Э. М., и Берд, Г. В. (2005). Интродуцированные хищники превращают субарктические острова из пастбищ в тундру. Наука 307, 1959–1961. doi: 10.1126/science.1108485

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Эдгар, Р. К. (2010). Поиск и кластеризация на несколько порядков быстрее, чем BLAST. Биоинформатика 26, 2460–2461. дои: 10.1093/биоинформатика/btq461

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Фиерер, Н., Лаубер, К.Л., Рамирес, К.С., Заневельд, Дж., Брэдфорд, М.А., и Найт, Р. (2012). Сравнительный метагеномный, филогенетический и физиологический анализ почвенных микробных сообществ в градиентах азота. ISME J. 6, 1007–1017. doi: 10.1038/ismej.2011.159

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хаас Б., Геверс Д., Эрл А. М., Фельдгарден М., Уорд Д. В., Яннукос Г. и др. (2011). Формирование и обнаружение химерной последовательности 16S рРНК в ампликонах Сэнгера и 454-пиросеквенированных ПЦР. Рез. генома. 21, 494–504. doi: 10.1101/gr.112730.110

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хаммер О., Харпер Д. А. Т. и Райан П. Д. (2001). ПРОШЛОЕ: Программный пакет палеонтологической статистики для обучения и анализа данных. Палеонтол. Электрон. 4, 1–9.

Исаксен, К. (1995). «Гнездящаяся популяция гагарки (Alle alle) в колониях Хорнсунда и Северо-Западного Шпицбергена», в «Популяциях морских птиц в северной части Баренцева моря». Нор Поляринст Медд , Том. 135, ред. К. Исак-сен и В. Баккен (Осло: Norsk Polarinstitutt), 49–57.

Янссен, П. Х. (2006). Выявление доминирующих таксонов почвенных бактерий в библиотеках генов 16S рРНК и 16S рРНК. Заяв. Окружающая среда. микроб. 72, 1719–1728 гг. doi: 10.1128/AEM.72.3.1719-1728.2006

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Kim, H.M., Jung, J.Y., Yergeau, E., Hwang, C.Y., Hinzman, L., Nam, S., et al. (2014). Структура бактериального сообщества и свойства почвы субарктической тундры в Совете, Аляска. ФЭМС микробиол. Экол . 89, 465–475. doi: 10.1111/1574-6941.12362

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Клиндворт А., Прюссе Э., Швеер Т., Пеплис Дж., Кваст С., Хорн М. и др. (2013). Оценка общих праймеров для ПЦР гена рибосомной РНК 16S для классических исследований и исследований разнообразия на основе секвенирования следующего поколения. Рез. нуклеиновых кислот. 41:e1. doi: 10.1093/nar/gks808

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кояма, А., Валленштейн, М. Д., Симпсон, Р. Т., и Мур, Дж. К. (2014). Состав почвенного бактериального сообщества изменяется в результате повышения доступности питательных веществ в почвах арктической тундры. Перед. Микробиол . 5:516. doi: 10.3389/fmicb.2014.00516

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Макдональд Д., Прайс М. Н., Гудрич Дж., Навроцкий Э. П., ДеСантис Т. З., Пробст А. и др. (2012). Улучшенная таксономия Greengenes с явными рангами для экологического и эволюционного анализа бактерий и архей. ISME J. 6, 610–618. doi: 10.1038/ismej.2011.139

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Nemerguta, D.R., Clevelandc, C.C., Wiedera, W.R., Washenbergera, C.L., and Townsenda, A.R. (2010). Манипуляции с поступлением органического вещества в почву в масштабе участка коррелируют со сдвигами в составе микробного сообщества в низинных тропических лесах. Почвенный биол. Биохим. 42, 2153–2160. doi: 10.1016/j.soilbio.2010.08.011

Полный текст CrossRef | Академия Google

Нойфельд, Дж. Д., и Мон, В. В. (2005). Неожиданно высокое разнообразие бактерий в арктической тундре по сравнению с почвами бореальных лесов, выявленное серийным анализом меток рибосомных последовательностей. Заяв. Окружающая среда. Микробиол . 71, 5710–5718. doi: 10.1128/AEM.71.10.5710-5718.2005

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Пучко, М., и Стемпневич, Л. (2013). «Географическая среда в окрестностях польской полярной станции Станислава Седлецкого в Хорнсунде. Птицы и млекопитающие», в Древние и современные геоэкосистемы Шпицбергена , ред. З. Зволинский, А. Костшевский и М. Пулина (Познань: Bogucki Wydawnictwo Naukowe), 81–84.

Шен, К., Сюн, Дж., Чжан, Х., Фэн, Ю., Линь, X., Ли, X., и др. (2013). pH почвы определяет пространственное распределение бактериальных сообществ вдоль возвышенности горы Чанбайшань. Почвенный биол. Биохим. 57, 204–211. doi: 10.1016/j.soilbio.2012.07.013

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Скшипек Г., Войтун Б., Рихтер Д., Якубас Д., Войчуланис-Якубас К. и Самецка-Цимерман А. (2015). Диверсификация источников азота в различных типах растительности тундры в высоких широтах Арктики. PLoS ONE 10:e0136536. doi: 10.1371/journal.pone.0136536

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Стемпниевич Л. (2001). Люрик Все . Дж. Бердс Вест. Палеарктика 3, 175–120.

Стемпневич, Л., Блаховяк-Самолик, К., и Веславски, Дж. М. (2007). Воздействие изменения климата на сообщества зоопланктона, популяции морских птиц и арктическую наземную экосистему — сценарий. Deep Sea Res. 54, 2934–2945. doi: 10.1016/j.dsr2.2007.08.012

CrossRef Full Text | Google Scholar

Уинсли, Т. Дж., Снейп, И., МакКинлей, Дж., Старк, Дж., ван Дорст, Дж. М., Джи, М., и др. (2014). Экологический контроль распространенности кандидата в деление TM7 в полярных регионах. Перед. Микробиол . 5:345. doi: 10.3389/fmicb.2014.00345

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Войцеховска А., Зволицкий А., Барчиковска А. и Стемпневич Л. (2015). Структура популяции Cochlearia groenlandica по градиенту влияния колонии птиц (Хорнсунд, Шпицберген). Полар Биол . 38, 1919–1930. doi: 10.1007/s00300-015-1755-3

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Заверуха К., Змудчиньска-Скарбек К., Качмарек Л. и Войчуланис-Якубас К. (2015). Влияние колонии морских птиц на численность и видовой состав водяных медведей (тихоходок) в Хорнсунде (Шпицберген, Арктика). Полар Биол . 39, 713–723. doi: 10.1007/s00300-015-1827-4

CrossRef Full Text | Google Scholar

Зеликман Э. А., Головкин А. Н. (1972). Состав, структура и продуктивность сообществ неритового планктона у птичьих колоний северного побережья Новой Земли. Мар Биол . 17, 265–274. doi: 10.1007/BF00366302

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Чжан Т., Ван Н.-Ф., Лю Х.-Ю., Чжан Ю.-К. и Ю Л.-Ю. (2016). pH почвы является ключевым фактором, определяющим состав почвенного грибкового сообщества в регионе Ню-Олесунн, Шпицберген (высокая Арктика). Перед. Микробиол . 7:227. дои: 10.3389/fmicb.2016.00227

Резюме PubMed | Полный текст CrossRef

Змудчиньска К. , Олейничак И., Зволицкий А., Илишко Л., Конвей П. и Стемпневич Л. (2012). Влияние аллохтонных питательных веществ, доставляемых колониальными морскими птицами, на почвенные коллемболовые сообщества Шпицбергена. Полярная биол. 35, 1233–1245. doi: 10.1007/s00300-012-1169-4

CrossRef Full Text | Google Scholar

Змудчиньска-Скарбек К., Балази П. и Куклински П. (2015a). Оценка влияния морских птиц на бентические сообщества арктического побережья. Дж. Мар. Сист . 144, 48–56. doi: 10.1016/j.jmarsys.2014.11.013

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Змудчиньска-Скарбек К., Зволик А., Конвей П., Барциковски М. и Стемпневич Л. (2015b). Важно ли орнитогенное оплодотворение для сообществ коллембол в арктических наземных экосистемах? Полярный рез. 34:25629. doi: 10.3402/polar.v34.25629

CrossRef Full Text

Зволицкий А., Барчиковский М., Барчиковский А., Цимерский М., Стемпневич Л. и Конвей П. (2015). Влияние колонии морских птиц на свойства почвы и зональность растительности на острове Кинг-Джордж, морская Антарктика. Полярная биол. 38, 1645–1655. doi: 10.1007/s00300-015-1730-z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зволицкий А., Змудчиньска-Скарбек К. М., Илишко Л. и Стемпневич Л. (2013). Отложения гуано и обогащение питательными веществами вблизи колоний планктоно- и рыбоядных морских птиц на Шпицбергене. Полярная биол. 36, 363–372. doi: 10.1007/s00300-012-1265-5

CrossRef Full Text | Google Scholar

Сравнение двух праймеров 16S рРНК (V3–V4 и V4–V5) для изучения микробных сообществ Арктики

Введение

Северный Ледовитый океан является наиболее быстро меняющимся морским регионом на планете из-за его быстрого потепления, вызывающего значительную потерю морского льда (Peng and Meier, 2018; Dai et al., 2019), а также увеличения загрязнения ( Пикен и др., 2018). Чтобы оценить влияние глобального изменения климата на динамику морской пищевой сети и циклы элементов, важно отслеживать изменения в структуре микробного сообщества во времени (Karl and Church, 2014; Fuhrman et al. , 2015; Buttigieg et al., 2018). . Тем не менее, Северный Ледовитый океан, как правило, недооценивается в покрытых льдом регионах и зимой (Wassmann et al., 2011), особенно в отношении оценок его микробных сообществ и их биогеохимических функций (Boetius et al., 2015). До недавнего времени усилия по микробному мониторингу в глубинах Северного Ледовитого океана состояли из одного круглогодичного долгосрочного временного ряда в обсерватории HAUSGARTEN в проливе Фрама (Soltwedel et al., 2005, 2015), а также нескольких других исследований процессов ( например, Kirchman et al., 2007; Alonso-Sáez et al., 2008; Nikrad et al., 2012; Wilson et al., 2017; Müller et al., 2018).

Северный Ледовитый океан имеет значительную вертикальную структуру, которая может отбирать определенные типы микробов в морском льду (Boetius et al., 2015; Rapp et al., 2018), в свободных ото льда и покрытых льдом сильно стратифицированных поверхностных водах (Wilson et al., 2017; Фадеев и др., 2018), в тонущих частицах (далее – «морской снег»; Фадеев и др. , 2020), а также в воде и отложениях глубоководных где температуры круглый год близки к температуре замерзания (Bienhold et al., 2012; Hoffmann et al., 2017; Wilson et al., 2017; Rapp et al., 2018; Фадеев и др., 2020). На протяжении годового цикла в бактериальных и архейных сообществах арктических поверхностных вод наблюдаются выраженные колебания доминирующих таксономических групп (Alonso-Sáez et al., 2008; Wilson et al., 2017; Müller et al., 2018), тесно связанные с наличие морского льда и сезонное цветение фитопланктона (Kirchman et al., 2007; Nikrad et al., 2012; Fadeev et al., 2018; Cardozo-Mino et al., 2020). Зимой, а также в условиях гололеда в сообществах преобладают бактериальные классы 9.0263 Alphaproteobacteria (в основном клада SAR11), Dehalococcoidia (в основном ветвь SAR202) и класс архей Nitrososphaeria (Alonso-Sáez et al., 2008; Wilson et al., 2017; Müller, 01.8 et al.) . Летом и в безледных условиях в сообществах преобладают бактерии классов Bacteroidia (в основном отряд Flavobacteriales ) и Gammaproteobacteria (в основном отряды Alteromonadales и 9). 0263 Океаноспириллы ; Уилсон и др., 2017; Фадеев и др., 2018). Летом различия между покрытыми льдом и свободными ото льда сообществами также влияют на микробное разнообразие глубоководных районов и морского дна через изменения микробных сообществ на морском снегу (Фадеев и др., 2020).

В рамках Микробиологической обсерватории FRAM (FRontiers в арктическом морском мониторинге) мы стремимся разработать стандартизированную методологию для долгосрочных наблюдений за микробными сообществами в этих весьма разнообразных средах Северного Ледовитого океана, которые также будут сопоставимы с другими долгосрочными – долгосрочные микробные временные ряды местоположений (например, HOT и BATS). В отличие от других участков временных рядов мира, ледяной покров и суровые условия Северного Ледовитого океана ограничивают доступность мест отбора проб летними месяцами. Кампании по отбору проб зимой (когда микробная биомасса невелика; Kirchman et al., 2007; Alonso-Sáez et al., 2008) проводятся редко и лишь недавно были проведены с использованием автономных пробоотборников с ограниченными возможностями отбора проб (Liu et al. , 2020). ). Таким образом, уникальные условия и доступные в настоящее время технологии ограничивают круглогодичные микробные наблюдения подходами, основанными на ПЦР (т. Подходы метагеномики предполагают, что функциональная способность морских микробных сообществ тесно связана с их таксономическим составом (Galand et al., 2018; McNichol et al., 2020). Таким образом, при поддержке тщательно подобранных таксономических баз данных (например, SILVA 16S rRNA gene reference; Quast et al., 2013) секвенирование ампликона гена 16S рРНК обеспечивает доступный высокопроизводительный инструмент для решения традиционных вопросов экологии сообщества, особенно в условиях ограниченного отбора проб. морской среды Арктики.

Важным шагом в исследованиях секвенирования гена 16S рРНК является выбор праймеров для ПЦР для амплификации ДНК (Armougom, 2009; Wang and Qian, 2009). На протяжении многих лет было разработано множество наборов праймеров для изучения разнообразия конкретных таксономических групп (например, клады SAR11; Apprill et al. , 2015), и были предприняты попытки разработать более универсальные наборы праймеров для гена 16S рРНК, которые могли бы охватывать почти все разнообразие природного микробного сообщества (например, Earth Microbiome Project; Caporaso et al., 2012; Gilbert et al., 2014). Разработка наборов праймеров для амплификации генов 16S рРНК ведется in silico с использованием справочных баз данных (например, Klindworth et al., 2013). Северный Ледовитый океан — самый маленький и мелкий из всех пяти океанов, занимающий 4% площади и 1% объема мирового океана. Тем не менее, он играет важную роль в глобальных процессах, на которые сильно влияют происходящие климатические изменения, и считается актуальным для нескольких переломных моментов Земной системы (Wassmann and Reigstad, 2011; Lenton et al., 2019). Более того, Северный Ледовитый океан, будучи самым холодным среди океанов, с сильной стратификацией и лишь ограниченным глубоководным обменом, вероятно, содержит уникальное эндемическое микробное разнообразие, которое определяет его биогеохимические циклы (Kirchman et al. , 2009).; Гиглионе и др., 2012; Педрос-Алио и др., 2015). Пример такого адаптированного к местным условиям арктического разнообразия был недавно обнаружен у специфичных для Арктики членов вездесущей клады SAR11 (Kraemer et al., 2020). Кроме того, несмотря на его глобальное значение, усилия по отбору проб в Северном Ледовитом океане невелики, особенно в и под морским льдом и в глубоководных бассейнах, а также в целом в зимнее время (Wassmann et al., 2011; Royo-Llonch et al. , 2020). Таким образом, в справочных базах данных, вероятно, отсутствует надлежащее освещение сложности и динамики микробиомов Северного Ледовитого океана, что может привести к их предвзятому представлению с помощью доступных в настоящее время праймеров гена 16S рРНК.

Одним из наиболее широко используемых наборов праймеров для исследования бактериального разнообразия в различных средах является 341F/785R (направленный на гипервариабельные области V3–V4 гена 16S рРНК), разработанный Klindworth et al. (2013). Для исследования морских микробиомов Парада и др. др. (2016). В настоящее время наборы праймеров V3–V4 и V4–V5 широко используются в исследованиях морских микробных сообществ и были тщательно протестированы с использованием искусственных и естественных сообществ умеренных вод (например, Wear et al., 2018; Willis et al., 2019).; Макникол и др., 2020). Однако ни одно исследование не проводило систематической проверки эффективности этих наборов праймеров на микробных сообществах Северного Ледовитого океана.

В попытке выбрать наиболее подходящий набор праймеров для долгосрочного мониторинга арктических микробных сообществ в рамках Молекулярной обсерватории FRAM мы представляем здесь сравнение производительности наборов праймеров для генов 16S рРНК V3–V4 (341F/785R ) и V4–V5 (515F-Y/926R). Наша гипотеза заключалась в том, что из-за относительно низкой представленности арктических микробных сообществ в общедоступных базах данных (из-за небольшого количества существующих исследований) наборы праймеров для генов 16S рРНК могут охватывать различные части микробного разнообразия в этих уникальных средах. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели прямое сравнение таксономического охвата и потенциальных погрешностей двух наборов праймеров в 37 полевых образцах, собранных в различных средах Северного Ледовитого океана, включая морской лед, поверхностную и глубокую толщу воды, морской снег, и глубоководные отложения. В качестве независимой линии проверки мы провели подсчет клеток пяти ключевых таксономических подгрупп в подмножестве полевых образцов 9.0263 через CARD-FISH (катализируемое осаждение репортера-флуоресценция гибридизация in situ ).

Материалы и методы

Сбор проб

Образцы, включенные в данное исследование, были собраны на площадке долговременных экологических исследований (LTER) HAUSGARTEN в проливе Фрама и центральной части Северного Ледовитого океана (дополнительный рисунок 1 и дополнительная таблица 1). Образцы были собраны следующим образом:

• Керны морского льда были собраны с помощью керна для льда (9диаметр см; Kovacs Enterprise, Роузбург, штат Орегон, США) и разбиты на подразделы для ускорения плавления. Нижние 30–50 см морского льда (в зависимости от общей длины керна) растапливали в пластиковых контейнерах (промытых этанолом и сверхчистой водой) при 4°С в темноте. Таяние морского льда длилось около 24 часов, и образцы сразу же фильтровались на мембранах Sterivex ^TM 0,22 мкм, как только растаял последний кусок морского льда. Дополнительные образцы для подсчета микроскопии фильтровали через поликарбонатные мембраны 0,22 мкм (Whatman Nucleopore, Buckinghamshire, United Kingdom) со стерильным отфильтрованным формалином в конечной концентрации 2% и хранили при -20°C.

• Отбор проб воды производился с использованием 12-литровых бутылей Нискина, установленных на розетке CTD (Sea-Bird Electronics Inc., зонд SBE 911 plus, Bellevue, WA, США) и фильтрованных через мембраны Sterivex ^TM 0,22 мкм. Мембраны Sterivex ^TM затем хранили при -20°C до дальнейшей обработки. Дополнительные образцы для подсчета микроскопии фильтровали через поликарбонатные мембраны 0,22 мкм (Whatman Nucleopore, Buckinghamshire, United Kingdom) со стерильным отфильтрованным формалином в конечной концентрации 2% и хранили при -20°C.

• Керны глубоководных отложений были извлечены с помощью мультиколонки с ТВ-наведением, а образцы верхнего сантиметра керна были собраны с помощью шприцев и немедленно сохранены при температуре -20°C до дальнейшей обработки.

• Пробы морского снега были собраны с помощью отстойников долговременных якорей на площадке LTER HAUSGARTEN (Bauerfeind et al., 2009; Lalande et al., 2013). Чашки для сбора (400 мл) были заполнены фильтрованной морской водой, доведенной до солености 40 и отравленной HgCl 9.0817 2 (конечный раствор 0,14 %), чтобы сохранить образцы во время развертывания и после восстановления (Metfies et al., 2017). После извлечения образцы хранились при +4°C, плавники удалялись и образцы разделялись методом мокрого расщепления (Bodungen et al., 2013). В этом исследовании мы использовали 1/32 расщепления исходной выборки ловушек. Тонущие частицы из проб отстойников собирали на фильтрах Sterivex 0,22 мкм и хранили при -20°C.

Все метаданные образцов доступны через Издатель данных для науки о Земле и окружающей среде PANGEA ¹ , идентификаторы событий PANGEA перечислены в дополнительной таблице 1. Карта выборки была создана с использованием Ocean Data View v5.2.1 (Schlitzer, 2018).

Выделение ДНК и секвенирование ампликона гена 16S рРНК

Геномная ДНК была выделена с помощью комбинированной химической и механической процедуры с использованием набора PowerWater DNA Isolation Kit для ловушек из морского льда, воды и отложений и с использованием набора PowerSoil DNA Isolation Kit для образцов отложений (MO BIO Laboratories, Inc., Карлсбад, Калифорния, США). Перед выделением ДНК 0,22 мкм Sterivex 9Мембранные картриджи 0295 TM с образцами морской воды и морского льда были вскрыты, чтобы поместить фильтры в поставляемые в комплекте трубки для взбивания шариков. Выделение продолжали в соответствии с инструкциями производителя, ДНК хранили при -20°С. Подготовку библиотеки выполняли в соответствии со стандартными инструкциями протокола подготовки библиотеки метагеномного секвенирования 16S (Illumina ^TM , Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Две разные гипервариабельные области бактериального гена 16S рРНК амплифицировали с использованием аликвот выделенной ДНК из каждого образца. Участок V3–V4 амплифицировали с использованием праймеров S-D-Bact-0341-b-S-17 (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) и S-D-Bact-0785-a-A-21 (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) (Klindworth и др., 2013). Участки V4–V5 амплифицировали с использованием 515F-Y (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′) и 926R (5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′) праймеры (Parada et al., 2016). Последовательности были получены на платформе Illumina MiSeq ^TM в цикле парных концов 2 × 300 п.н. и для образцов поверхностной воды на платформе Illumina HiSeq ^TM в цикле парных концов 2 × 250 п.н. (CeBiTec, Билефельд, Германия). ), следуя стандартным инструкциям протокола подготовки библиотеки метагеномного секвенирования 16S.

Необработанные считывания с парными концами и обрезанными праймерами были депонированы в Европейском архиве нуклеотидов (ENA; Harrison et al., 2019).) под инвентарным номером PRJEB31938. Данные были заархивированы с помощью брокерской службы Немецкой федерации биологических данных (GFBio; Diepenbroek et al. , 2014).

Биоинформатика и статистический анализ

Необработанные чтения парных концов были обрезаны праймерами с использованием cutadapt (Martin, 2011). Дальнейшие анализы проводились с использованием R v4.0.0 ² в RStudio v1.2.5042 ³ . Библиотеки обрабатывали с помощью DADA2 v1.16 (Callahan et al., 2016a) в соответствии с предложенным рабочим процессом (Callahan et al., 2016b). Чтения в библиотеках MiSeq были усечены до длины 255 п.н. для прямого считывания и до 200 п.н. для обратного считывания, чтобы способствовать падению технического качества в конце считывания. Прочтения как в MiSeq, так и в HiSeq затем были обрезаны для низкокачественных оснований и объединены на основе минимального перекрытия в 10 п.н. Химеры и варианты последовательности ампликонов (ASV), которые наблюдались только в одном образце, отфильтровывались. Репрезентативные последовательности были таксономически классифицированы по справочной базе данных генов SILVA 16S рРНК, версия 138 (Quast et al. , 2013; Yilmaz et al., 2014). ASV, которые таксономически не были классифицированы в ранге типа или не были отнесены к бактериальным или архейным линиям, были исключены из дальнейшего анализа. Кроме того, из набора данных были удалены все ASV, таксономически отнесенные к митохондриям и хлоропластам.

Матрицы выборочных данных управлялись с помощью пакета R «phyloseq» версии 1.32 (McMurdie and Holmes, 2013), а графики были созданы с использованием пакета R «ggplot2» версии 3.3.0 (Gómez-Rubio, 2017). Анализы разрежения проб проводились с использованием пакета R «iNEXT» v2.0.20 (Hsieh et al., 2016). Для проверки влияния разных наборов праймеров на таксономический состав микробных сообществ, а также для проверки различий между микробными сообществами разных типов образцов был применен двухфакторный перестановочный многомерный дисперсионный анализ («Двусторонний PERMANOVA» ) матрицы расстояний Дженсена-Шеннона (с использованием функции «adonis2» в R-пакете «vegan» v.2.5.6; Oksanen et al. , 2007).

Скрипты для обработки данных доступны по адресу https://github.com/edfadeev/Arctic-16S-Primers-comparison/.

Катализированное репортерное осаждение, флуоресценция

Образцы морского льда и морской воды были непосредственно зафиксированы в 4% формалине в течение 4 ч при 4°C, отфильтрованы на поликарбонатных протравленных мембранах 0,22 мкм ^TM (Whatman Nucleopore, Бакингемшир, Великобритания) и хранили при температуре -20°C. CARD-FISH применяли на основе протокола, установленного Pernthaler et al. (2002) с использованием олигонуклеотидных зондов, меченных пероксидазой хрена (HRP) ( ⁴ Ульм, Германия; Дополнительная таблица 4). Все зонды были проверены на специфичность и охват их целевых групп по эталонному гену SILVA 16S рРНК. Все фильтры заключали в 0,2% агарозу с низкой температурой гелеобразования и обрабатывали раствором лизоцима 10 мг/мл ^–1 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Гамбург, Германия) в течение 1 ч при 37°C. Затем эндогенные пероксидазы инактивировали, погружая кусочки фильтра в 0,15% раствор H ₂ O ₂ в метаноле на 30 мин, затем промывая водой Milli-Q и обезвоживая в 96% этанол. Затем фильтры покрывали буфером для гибридизации и концентрацией зонда 0,2 нг мкл ^–1 . Гибридизацию проводили при 46°С в течение 2,5 ч с последующей промывкой в ​​предварительно нагретом промывочном буфере при 48°С в течение 10 мин и 15 мин в 1x PBS. Амплификацию сигнала проводили в течение 45 мин при 46°C с буфером для амплификации, содержащим либо Alexa 488, связанную с тирамидом (1 мкг/мл ^–1 ), либо Alexa 594 (0,33 мкг мл ^–1 ). После этого клетки докрашивали в 1 мкг/мл ^–1 DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндол; Thermo Fisher Scientific GmbH, Бремен, Германия) в течение 10 мин при 46°С. После промывки водой Milli-Q и 96% этанолом кусочки фильтра заливали смесью 4:1 Citifluor (Citifluor Ltd., Лондон, Великобритания) и Vectashield (Vector Laboratories, Inc. , Берлингейм, США) и хранить в течение ночи при температуре -20°C для последующей микроскопии.

Автоматическое получение изображений и подсчет клеток

Фильтры оценивали под микроскопом на стенде Zeiss Axio Imager.Z2 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Йена, Германия), оснащенном многоцелевой полностью автоматизированной системой визуализации микроскопа (MPISYS), светодиодом Colibri. система подсветки источника света и набор мультифильтров 62HE (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Йена, Германия). Снимков было сделано через охлаждаемую камеру с зарядовой связью (ПЗС) (AxioCam MRm; Carl Zeiss AG, Оберкохен, Германия) с масляным объективом с увеличением 63x, числовой апертурой 1,4 и размером пикселя 0,1016 мкм/пиксель, в сочетании с программное обеспечение AxioVision SE64 Rel.4.9.1 (Carl Zeiss AG, Оберкохен, Германия), как описано Bennke et al. (2016). Время экспозиции было скорректировано после ручной проверки с помощью программного обеспечения AxioVision Rel.4.8, соединенного с программным обеспечением SamLoc 1. 7 (Zeder et al., 2011), которое также использовалось для определения координат фильтров на предметных стеклах. Для получения изображения каналы были определены с помощью программного обеспечения MPISYS, и было получено не менее 55 полей зрения с минимальным расстоянием 0,25 мм для каждого элемента фильтра путем записи z – стек из семи изображений в автофокусе.

Подсчет клеток проводили с помощью программного обеспечения Automated Cell Measuring and Enumeration Tool (ACMETool3, 09.11.2018; M. Zeder, Technobiology GmbH, Бухрейн, Швейцария). Клетки считались объектами по заданным вручную параметрам отдельно для каналов DAPI и FISH.

Результаты и обсуждение

В этом исследовании аликвоты 37 образцов ДНК из различных сред Северного Ледовитого океана (морской лед, поверхностные и глубокие океанские воды, морской снег и донные отложения; дополнительная таблица 1) были секвенированы с использованием двух общих праймеров. наборы, которые амплифицируют либо гипервариабельные области V3–V4, либо V4–V5 в гене 16S рРНК, и были подвергнуты одному и тому же биоинформационному рабочему процессу. Оба набора праймеров показали одинаковое уменьшение количества последовательностей на протяжении всего рабочего процесса: 62 ± 13 % и 68 ± 9 %.% последовательностей, сохраненных на образец, соответственно. Окончательные наборы данных состояли из 3 318 649 последовательностей в наборе данных V3 – V4, которые были назначены 12 045 ASV, и 3 340 628 последовательностей в наборе данных V4 – V5, которые были назначены 14 505 ASV (дополнительная таблица 2). Кроме того, из дальнейшего анализа были удалены ASV, таксономически отнесенные к последовательностям эукариот, митохондрий или хлоропластов, а также ASV, не классифицированные в ранге типа (около 9% и около 17% последовательностей в V3–V4 и V4). – наборы данных V5 соответственно). В обоих наборах данных асимптотическая экстраполяция кривых разрежения не привела к дальнейшему увеличению количества наблюдаемых ASV (дополнительная фигура 2). Хотя, скорее всего, дальнейшее микробное разнообразие еще предстоит обнаружить во всех отобранных средах, кривые разрежения показывают, что наши образцы содержали большую часть потенциального богатства сообщества, охватываемого обоими наборами праймеров. В морском льду, поверхностных водах (глубина <30 м) и морском снегу оба набора праймеров показали одинаковое богатство сообществ (рис. 1). Однако в глубоководных сообществах (глубина более 600 м) богатство значительно различалось между наборами праймеров (критерий знакового ранга Уилкоксона; 9).0263 p < 0,01), прибл. На 40 % больше бактериальных ASV в V3–V4. Напротив, богатство сообщества отложений было значительно выше в наборе данных V4–V5 (критерий знакового ранга Уилкоксона; p <0,01), с удвоенным количеством бактериальных ASV по сравнению с набором данных V3–V4. Основные таксономические группы, обычно наблюдаемые в арктической морской среде, такие как классы Alphaproteobacteria , Bacteroidia и Gammaproteobacteria , доминировали в обоих наборах данных (каждый из которых включает 10–30% последовательностей в V3–V4 и V4–V4). наборы данных соответственно). Однако внутри этих групп были обнаружены существенные различия между наборами данных по количеству наблюдаемых ASV.

Рисунок 1. Оценки богатства Chao1 в разных типах выборок. Различные наборы праймеров представлены цветами и формами. Обратите внимание на различия по осям и между панелями.

В наборе данных V3–V4 Bacteroidia и Gammaproteobacteria показали самые высокие различия в количестве наблюдаемых ASV в каждом классе (т. Е. Богатство типов) по сравнению с набором данных V4–V5 (дополнительная таблица 2). Семейство Flavobacteriaceae (класс Bacteroidia ) составлял 18% всех последовательностей в обоих наборах данных; однако в наборе данных V3–V4 он состоял на одну треть больше ASV по сравнению с набором данных V4–V5 (всего 278 и 196 ASV соответственно; рис. 2). Эта разница в количестве наблюдаемых ASV была в основном связана с ASV рода Polaribacter (всего 28 и 14 ASV соответственно), ключевой гетеротрофной бактерией, реагирующей на цветение фитопланктона в средних и высоких широтах (Gómez-Pereira). и др., 2010; Фадеев и др. , 2018; Avcı и др., 2020). заказы Alteromonadales , Cellvibrionales и Oceanospirillales (все в классе Gammaproteobacteria ), которые составляют 4–6% всех последовательностей в наборе данных V3–V4 и 3% всех последовательностей в наборе данных V4–V5, также показали различия между наборами данных по количеству наблюдаемых ASV (дополнительная таблица 3). Каждый из этих порядков Gammaproteobacteria содержал в два раза больше ASV в наборе данных V3–V4 по сравнению с набором данных V4–V5 (наибольшая разница была в порядке 9).0263 Alteromonadales , всего 113 и 49 ASV соответственно). Эти таксономические группы обычно связаны с деградацией органического вещества (Buchan et al., 2014), и ранее было показано, что они доминируют в микробных сообществах морского льда, связанных с скоплениями водорослей (Rapp et al., 2018), а также в поверхностных водах во время цветения фитопланктона. (Фадеев и др., 2018). Кроме того, семейство Woeseiaceae (класс Gammaproteobacteria ) также состояло из ок. На 30 % больше ASV в наборе данных V3–V4 по сравнению с набором данных V4–V5 (всего 127 и 98 АСВ соответственно; Фигура 2). Это семейство бактерий широко распространено в глубоководных отложениях по всему миру, включая Северный Ледовитый океан (Bienhold et al., 2016; Hoffmann et al., 2020).

Рисунок 2. Основные таксономические семейства в наборах данных V3–V4 и V4–V5. Ось x представляет общую долю последовательностей каждого семейства в наборах данных V3–V4 (левая панель) и V4–V5 (правая панель). Числа в каждом столбце представляют количество наблюдаемых ASV, связанных с каждым таксономическим семейством. Различные таксономические классы представлены цветовым кодом. В визуализацию были включены только семейства, которые включали не менее 1% последовательностей хотя бы в один из наборов данных.

По сравнению с набором данных V3–V4, набор данных V4–V5 содержал как минимум на треть больше ASV в классах Phycisphaerae (всего 206 и 117 ASV соответственно) и Planctomycetes (всего 299 и 244 ASV). , соответственно). Эта разница в количестве наблюдаемых ASV была в основном связана с семействами Pirellulaceae , которые включали ок. 2% всех последовательностей в обоих наборах данных (рис. 2), а также Phycisphaeraceae , которые составляют менее 1% всех последовательностей (дополнительная таблица 3) в обоих наборах данных. Ранее было показано, что эти таксономические группы связаны с тонущими частицами в глубоком океане, а также широко распространены в арктических глубоководных отложениях (Фадеев и др., 2020). Кроме того, археи класса Nitrososphaeria почти отсутствовала в наборе данных V3–V4, и только несколько последовательностей были связаны с четырьмя ASV, по сравнению с 168 ASV в наборе данных V4–V5, которые составляли 7% от общего числа последовательностей (рис. 2). Морские представители Archaea в целом и класс Nitrososphaeria в частности широко распространены в арктической морской среде и могут достигать до одной пятой клеток арктических микробных сообществ (Müller et al. , 2018; Cardozo- Мино и др., 2020). Взятые вместе, эти наблюдения предполагают, что на уровне ASV разнообразие различных таксономических групп по-разному фиксируется двумя наборами праймеров. Потенциально это является результатом различий в региональной гипервариабельности гена 16S рРНК в разных таксономических группах (Yang et al., 2016; Kerrigan et al., 2019).). Кроме того, как было показано ранее для различных таксономических групп, таких как клада SAR11, различия в захваченном разнообразии могут возникать также из-за различий в специфичности наборов праймеров к целевой области гена 16S рРНК (Parada et al., 2016).

Несмотря на наблюдаемые различия на уровне ASV, общий таксономический состав наборов данных был одинаковым (рис. 3). В пробах морского льда, поверхностных вод и морских снежных сообществ преобладали гетеротрофные бактерии классов 9.0263 Bacteroidia (в основном род Polaribacter ) и Gammaproteobacteria (в основном роды порядка Alteromonadales ), с относительной численностью последовательностей, эквивалентной той, что описана в предыдущих отчетах (Bowman et al. , 2012; Eronen-Rasimus et al., 2016; Hatam et al., 2016; Wilson et al., 2017; Fadeev et al., 2018, 2020; Rapp et al., 2018). На глубине в пелагических сообществах преобладали последовательности класса Alphaproteobacteria , клады SAR324 и 9 класса архей.0263 Nitrososphaeria , все из которых ранее наблюдались как доминирующие в глубоководных арктических водах, а также в поверхностных сообществах во время арктической зимы (Wilson et al., 2017; Фадеев и др., 2020). Сообщества отложений, которые, как было показано ранее, обладают самым высоким таксономическим разнообразием среди описанных арктических сред (Bienhold et al., 2012; Hoffmann et al., 2017; Rapp et al., 2018), доминировали по численности последовательностей. из Гаммапротеобактерии .

Рис. 3. Таксономический состав микробных сообществ. Различные таксономические классы представлены цветовым кодом. Классы с долей последовательности ниже 2% были классифицированы как «Другие таксоны».

Чтобы сравнить различия в представлении таксономических групп между наборами праймеров, мы объединили обилие последовательностей всех ASV в соответствии с их таксономической принадлежностью в ранге рода (т. е. максимально возможное общее таксономическое разрешение между наборами данных). В наборе данных V3–V4 ASV были объединены в 306 различных родов и 279линии, которые относились к более высоким таксономическим рангам (т. Е. Не классифицировались по родовому рангу). В наборе данных V4–V5 ASV были объединены в 280 различных родов и 299 линий, которые относились к более высоким таксономическим рангам. Всего в обоих наборах данных на этом уровне таксономического разрешения наблюдалось 489 (72% от общего числа) линий. В наборе данных V3–V4 было 96 (14% от общего числа) линий, которые отсутствовали в наборе данных V4–V5, но вместе они составляли менее 1% последовательностей в наборе данных V3–V4. С другой стороны, в наборе данных V4–V5 было 90 (13% от общего числа) линий, которые отсутствовали в наборе данных V3–V4, и вместе они составляли 5% последовательностей в наборе данных V4–V5. Кроме того, несходство составов сообществ в объединенных наборах данных V3–V4 и V4–V5 выявило устойчивую и значительную разницу между микробиомами, захваченными обоими наборами праймеров (двусторонний тест PERMANOVA; F _4,64 = 86,29, ). R ² = 0,83, p значение < 0,001 (рис. 4). Только небольшая часть общей дисперсии была связана с различием между наборами праймеров (двусторонний тест PERMANOVA; 9).0263 F _1,64 = 7,59, R ² = 0,02, p значение < 0,001). Не наблюдалось значительного комбинированного эффекта различных наборов праймеров на разные типы образцов (двусторонний тест PERMANOVA; значение p > 0,05). Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что, хотя наборы праймеров показали разную чувствительность к разнообразию на уровне ASV, оба они отражают сходный таксономический состав вплоть до ранга рода.

Рис. 4. Неметрическое многомерное шкалирование (NMDS) микробных сообществ в объединенных наборах данных V3–V4 и V4–V5 на основе расхождения Дженсена-Шеннона. Различные типы образцов представлены цветами, а набор букварей представлен формами. Эллипсы охватывают кластеризацию каждого типа микробиома с нормальной достоверностью 0,95.

Исследования микробной обсерватории FRAM сосредоточены на изучении сезонной и межгодовой динамики Северного Ледовитого океана, связанной с изменениями площади морского льда и первичной продукции в поверхностных слоях океана (например, Metfies et al., 2017; Fadeev et al., 2018, 2020). Чтобы дополнительно оценить эффективность двух наборов праймеров в этих условиях длительного мониторинга, мы сравнили представление последовательности выбранных таксономических групп, которые связаны с отдельными стадиями сезонной динамики (Фадеев и др., 2018), с клетками, подсчитанными под микроскопом. с использованием CARD-FISH в сочетании с автоматическим получением изображений (Cardozo-Mino et al., 2020). Флуоресценция 9Преимущество методов гибридизации 0263 in situ заключается в обеспечении абсолютного содержания (жизнеспособных) клеток, которое можно непосредственно сравнивать между образцами. При микроскопическом учете сообществ как морского льда, так и поверхностных вод самая высокая наблюдаемая численность клеток была у класса Bacteroidia (до 35 и 26% от общего микробного сообщества соответственно), что согласуется с представленностью этой таксономической группы оба комплекта праймеров. В сообществах поверхностных вод высокий уровень согласованности между подсчетами микроскопии и обоими наборами праймеров наблюдался также в представлении Alteromonadales и Polaribacter (табл. 1). С другой стороны, представленность по обоим наборам праймеров класса Gammaproteobacteria в сообществах морского льда и поверхностных вод была в 2–4 раза выше по сравнению с долей, наблюдаемой при микроскопии (до 9 и 18% соответственно). ). Напротив, пропорциональная распространенность клады SAR11 была в 5–10 раз выше при микроскопии по сравнению с ее представлением обоими наборами праймеров (таблица 1). Наши результаты показывают, что, по крайней мере, для некоторых таксономических групп (например, Polaribacter ), оба набора праймеров могут обеспечить последовательное полуколичественное представление. Однако результаты микроскопии следует интерпретировать с учетом нескольких методологических предостережений, зная, что низкое содержание клеточных рибосом или низкая эффективность зонда могут изменить представление отдельных таксонов в наших подсчетах клеток (Amann and Fuchs, 2008). Следовательно, наблюдаемое несоответствие в представлении некоторых таксономических групп (например, клады SAR11) также может быть результатом этих ограничений. Для дальнейшего изучения количественной эффективности наборов праймеров необходимо дальнейшее исследование с использованием таких методов, как имитационные сообщества (Yeh et al., 2019) или метагеномики (McNichol et al., 2020).

Таблица 1. Обзор распространенности клеток и диапазона пропорций последовательностей в выбранных таксономических группах.

Заключительные замечания

Чтобы понять связи между быстрыми изменениями окружающей среды в арктическом регионе и динамикой микробных сообществ в Северном Ледовитом океане, необходимы надежные методы, учитывающие изменения в разнообразии и относительной численности. Для проведения таких наблюдений с использованием подхода секвенирования гена 16S рРНК необходимо оптимально подобрать аналогичный метод выделения и один набор праймеров для ПЦР, которые можно применять ко всем средам Северного Ледовитого океана (морской лед, толща воды и глубоководные отложения). Наиболее подходящий набор праймеров для амплификации и секвенирования 16S рРНК из образцов окружающей среды должен давать высококачественные библиотеки ампликонов и охватывать с минимальными погрешностями разнообразие существующих организмов, а также их относительную численность. Мы обнаружили, что на всех таксономических рангах вплоть до рода оба набора праймеров представляют собой общее богатство основных таксономических групп бактерий на сопоставимых уровнях в различных биомах Северного Ледовитого океана. Относительное обилие последовательностей некоторых доминирующих таксономических групп, таких как Polaribacter соответствует их пропорциональному представлению через микроскопических количества клеток. Другие таксономические группы, такие как клада SAR11, сильно различаются между молекулярными и микроскопическими представлениями. Однако это несоответствие может быть связано с ограничениями микроскопического количественного определения. На уровне ASV оба набора праймеров по-разному отражают разнообразие наиболее распространенных таксономических групп, и, таким образом, использование каждого набора праймеров может зависеть от целевых групп. Однако основным преимуществом набора праймеров V4–V5 является его дополнительный охват домена архей без ущерба для обнаружения других таксономических групп. Члены Археи составляют значительную часть арктических морских микробных сообществ, особенно в темное время года и в глубоких водах. Таким образом, учитывая продемонстрированные сходства и различия, мы одобряем использование набора праймеров V4–V5 для получения всестороннего понимания динамики микробных сообществ морской среды Арктики.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях. Названия репозитория/репозиториев и инвентарные номера можно найти в статье/дополнительных материалах.

Вклад авторов

EF и AB разработали исследование. CB, IS, MM и JR предоставили образцы окружающей среды для исследования. HT провел секвенирование образцов. MC-M и VS-C провели подсчет CARD-FISH. EF проанализировал данные и написал рукопись. Все авторы внесли свой вклад в окончательную версию рукописи.

Финансирование

Работа выполнена в рамках инфраструктурной программы HGF FRAM Центра полярных и морских исследований им. Гельмгольца Института Альфреда-Вегенера. Проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7/2007-2013) исследовательского проекта ABYSS (грантовое соглашение № 29).4757) присуждена AB. Дополнительное финансирование поступило от Австрийского научного фонда (FWF) M-2797 в пользу EF. Эта публикация имеет номер Eprint ID 53010 Института полярных и морских исследований им. Альфреда Вегенера, Бремерхафен, Германия.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности