КНС, Комплектная канализационная насосная станция ARMOPLAST, Цена
Монтаж
Монтаж комплектной КНС осуществляется под землю, при этом на поверхности остается только смотровой люк для обслуживания.
Она может размещаться как под газоном, так и под проезжей частью, но в последнем случае, над станцией необходимо предусмотреть разгрузочную плиту, а стеклопластиковые люки заменить на чугунные.
Видео - монтаж емкостного оборудования из стеклопластика
- Перед установкой корпуса станции перекачки сточных вод роется котлован, готовится хорошо утрамбованное грунтовое основание, на котором укладывается (или отливается) армированная фундаментная плита, рассчитанная заранее по нагрузке и гидрогеологическим условиям грунта.
- Устанавливается корпус КНС и фиксируется анкерными соединениями на фундаменте, осуществляется подсоединение входных и выходных патрубков.
Далее производится обратная засыпка корпуса песком с послойным трамбованием. - С помощью направляющих монтажных механизмов опускаются насосы, подвешиваются и выставляются по уровням поплавковые датчики и подключаются электрические кабели к пульту управления, который, в зависимости от варианта исполнения, может размещаться как в сухом отапливаемом помещении, так и на открытом воздухе, в специальном корпусе.
Принцип работы
Принцип работы КНС Armoplast заключается в аккумуляции поступающего объема перекачиваемых сточных вод в резервуаре через входные патрубки со съемным контейнером, мусор из которого периодически удаляется на утилизацию на полигон ТБО.
Накопление жидкости происходит до определенного уровня, который устанавливается поплавковым датчиком. По сигналу датчика происходит запуск насосного агрегата и начинается откачка жидкости через распределительные патрубки.
За счет установки резервного насосного агрегата, поплавковых выключателей и пульта автоматического управления возможна организация различных режимов работы канализационной насосной станции, диктуемых спецификой условий её применения.
Могут быть предусмотрены варианты дополнительного запуска резервного насоса при увеличении притока перекачиваемого стока, а также автоматического переключения насосов при аварии одного из них. Кроме того, имеется режим выравнивания моторесурса насосного оборудования путем чередования запусков рабочего и резервного насосов за счет автоматического переключения с равными временными интервалами.
Пульт управления сигнализирует о работе насосов, их аварии и переполнении КНС. Прекращение их работы происходит при отсутствии поступления жидкости в резервуар по нижнему уровню поплавкового выключателя.
Обслуживание
Обслуживание комплектной канализационной насосной станции производится в соответствии с технической документацией на оборудование и технологическим регламентом по эксплуатации объекта.
Комплектная КНС
Комплектная КНС (канализационная насосная станция) в отличие от обычных КНС изготавливается и полностью укомплектовывается в заводских условиях.
Комплектная КНС оснащается современными погружными насосами. Современные погружные насосы надежны и экономичны, имеют низкий уровень вибрации и шума. Такие КНС по сравнению с традиционными сооружениями позволяют в два и более раз снизить их себестоимость и значительно сократить сроки строительных работ.
Комплектная КНС – основные преимущества
Комплектные КНС полной заводской готовности имеют гораздо меньший объем строительно-монтажных работ. Станции такого типа работают в автоматическом режиме. Приемный резервуар комплектной КНС имеет меньшие размеры, благодаря тому, что прямо в нем размещены погружные насосы. Потери напора в станциях с погружными насосами также значительно меньше, чем в обычных насосных станциях, что позволяет снизить затраты энергии на перекачивание сточных вод.
Благодаря оптимизированной работе, современная КНС с 3-метровым рабочим диаметром три метра способна заменить традиционную железобетонную насосную станцию диаметром 6 - 15 метров.
Традиционные КНС предполагают наличие двух помещений, в одном из которых располагается приемный резервуар с решетками, а в другом – машинный зал. Помещения разделены водонепроницаемой перегородкой. Такая система требует ежедневного опорожнения решетки, а соответственно – присутствия персонала.
Устройство станции
Комплектная КНС представляет собой емкость в форме цилиндра. Материал, применяемый для изготовления корпуса – полиэтилен, стеклопластик, полипропилен, нержавеющая сталь. В корпус станции вварены патрубки, через которые присоединяются напорные трубопроводы и коллектор подвода сточных вод, по которым идет подача сточных вод.
Чтобы в насос не попадали крупные включения, коллектор подвода оборудуется специальной решеткой ковшового типа.
Размер просвета в решетке определяется проходным сечением рабочего колеса насоса. Решетка может подниматься по специальным направляющим вручную или посредством тали.
Варианты КНС
Комплектная КНС может быть снабжена павильоном над его подземной частью, а может быть смонтирована и без него. В случае сооружения павильона в нем размещают контейнер, в котором собирается крупный мусор, задержанный решеткой. Здесь же может располагаться щит управления, а также механизмы, обеспечивающие подъем и опускание решетки.
Обслуживание и управление
В случае необходимости чистки или ремонта насосы опускают или поднимают на поверхность по направляющим тросом, с помощью тали.
КНС укомплектовывается герметично закрываемым люком, вентиляционной трубой и лестницей для обслуживания станции. Напорные линии насосов снабжаются задвижками и обратными клапанами. В станции могут использоваться насосы с режущими устройствами, с помощью которых измельчают крупные включения.
Это позволяет реже удалять мусор из решетки.
Автоматической работой станции управляет специальная модульная система, которая включает и выключает насосы на основе сигналов датчиков уровня. Система автоматического управления может быть вынесена на поверхность, при этом она помещается в запирающийся на замок защитный кожух.
Монтаж КНС
При установке КНС в тяжелых гидрогеологических условиях (подтопление) не требуется проводить работы по понижению уровня грунтовых вод. Единственное, что требуется при установке станции – основа из уплотненного песка. Чтобы предотвратить всплытие станции, ее утяжеляют каким-либо методом. Это может быть железобетонное кольцо, в которое устанавливается станция, или подложенная снизу железобетонная плита, размеры которой больше, чем днище станции. В этом случае края плиты, выступающие из-под станции, дополнительно пригружаются при засыпке котлована.
Комплектные станции благодаря простоте монтажа и надежности в работе завоевывают все большую популярность при сооружении систем водоотвода.
Примечание: Заполните известные вам пункты
| 1 | Максимальный приток сточных вод, м3/час | ||
| 2 | Расчетный напор насоса, м | ||
| 3 | Количество рабочих насосов в КНС, шт | ||
| 4 | Количество резервных насосов в КНС, шт | ||
| 5 | Количество запасных насосов на склад, шт | ||
| 6 | Глубина залегания сливного трубопровода Нвход, мм | ||
| 7 | Наружный диаметр сливного трубопровода Dвход, мм | ||
| 8 | Глубина залегания напорного трубопровода Нвыход, мм | ||
| 9 | Наружный диаметр напорного трубопровода Dвыход, мм | ||
| 10 | Количество напорных трубопроводов, шт | ||
| 11 | Длина напорного трубопровода, м | ||
| 12 | Разность геодезических высот начала и конца напорного трубопровода, м | ||
| 13 | Исполнение щита управления |
в помещении уличное |
|
| 14 |  питания |
один два с АВР |
|
| 15 | Требуется ли изготовление наземного павильона над КНС |
да нет |
|
|
Дополнительные требования: |
Комплектные насосные станции, описание комплектной КНС
Комплектная кнс является комплексом гидротехнического оборудования и сооружений. Комплектные КНС специально спроектированы для перекачки ливневых сточных вод, промышленных и хозяйственно-бытовых стоков. Их использование актуально в случаях, когда стекание жидкости самотеком не представляется возможным.
Комплектная канализационная насосная станция включает в себя набор блоков и блок-боксов, которые дополняются технологическими трубопроводами и вспомогательными системами.
Область применения комплектных кнс
Применение насосных и компрессорных станций актуально на объектах, в которых осуществляется добыча и перекачивание нефти, газа, воды, очищенных и канализационных стоков. Потребность в их использовании возникает при отсутствии возможности подать жидкость самотеком до места назначения. Эти виды кнс устанавливаются в поселках, микрорайонах, отдельно стоящих зданиях и группах домов. Актуальна их эксплуатация также в устройствах ливневой канализации. Комплекс комплектных кнс обеспечивает сбор стоков и их перекачивание на очистные сооружения или в канализационный коллектор.
Отгрузка комплектной канализационной насосной станции (КНС), диаметр 4 м . Группа Кампаний Полихим
Особенности конструкции комплектных канализационных насосных станций
К сооружению блочно-комплектных насосных станций и компрессорных комплексов предъявляются требования к сокращению сроков монтажа.
Проектирование и сооружение должно осуществляться профессионалами с соблюдением требований ВНТП 01-87-04-84 и ОСТ 26.260.18-2004. Оборудование также должна отвечать категории размещения 1 по ГОСТ 15150.
В зависимости от конструктивного исполнения комплектные КНС делятся на следующие виды:
- с приемной камерой;
- с погружным исполнением;
- с решеткой и грабельным отделением.
Комплекс таких станций может дополнительно комплектоваться измельчителями и дробилками, обеспечивающими измельчение крупных фракций.
В результате заказчикам не приходится устанавливать трубопроводы с большим диаметром. Наличие дополнительных функциональных устройств также обеспечивает увеличение срока эксплуатации все системы.
Что входит в комплектную кнс?
В зависимости от модели комплектные насосные станции могут включать в себя разные составляющие. В основном производители устанавливают следующие из них:
- технологическое оборудование: фильтры, насосы и пр.;
- емкости разного объема и формы;
- технологические трубопроводы с арматурой: запорной, регулирующей или предохранительной;
- измеряющие, контролирующие или автоматизирующие приборы;
- обслуживающие устройства: ручные тали, грузовые тележки, площадки обслуживания, лестницы и пр.
Блочно-комплектные конструкции поставляются на рабочий объект в виде отдельных транспортных частей, которыми являются блок-боксы. Кроме того, они могут транспортироваться на площадку в полностью собранном виде, готовыми для последующей установки и эксплуатации.
Комплектация может меняться в зависимости от пожеланий заказчика, так как системы создаются по индивидуальному проекту.
Всё автоматизировано
Блочно-комплектные насосные канализационные станции могут работать в двух режимах:
- Ручной предусматривает включение и отключение каждого агрегата индивидуально, а контроль работы осуществляется с помощью специальных светодиодных индикаторов.
- В автоматическом режиме эксплуатация происходит без необходимости в постоянном присутствии обслуживающего персонала. Обеспечивается расчетная и пиковая нагрузка, а также защита от возникновения аварийных ситуаций. Если кнс наполняется до аварийного уровня, срабатывает звуковая и световая сигнализация.
Автоматизация комплектной станции обеспечивает облегчение процесса обслуживания, высокую безопасность и функциональность. Предусмотрено местное и дистанционное управление. В первом случае применяются кнопочные посты управления, имеющие световую индикацию.
Дистанционное можно совершать от АРМ оператора. Комплектная насосная станция пожаротушения и другие виды оборудования снабжаются специальными датчиками, способными отслеживать состояние системы и сигнализировать о его изменении. В результате персоналу предприятия приходится направлять минимум усилий на обслуживание, что позволяет сократить трудовые и временные затраты.
Преимущества применения
Актуально использование комплектных КНС благодаря следующим преимуществам:
- возможность автоматизации и снижения трудовых затрат;
- надежность эксплуатации и отсутствие частых аварийных ситуаций;
- постоянный контроль работоспособности;
- большой выбор опций для комплектации;
- высокое качество исполнения;
- изготовление по индивидуальному проекту заказчика;
- экономия эксплуатационных затрат;
- высокая эффективность работы;
- продолжительный срок службы.
Комплекс технологических устройств обеспечит быстрый сбор и отвод стоков в канализационный коллектор или на очистные сооружения.
Соблюдение требований во время проектировки и монтажа гарантирует отсутствие хлопот во время эксплуатации.
Комплектная канализационная насосная станция. Статьи компании «"СантехПроект" Емкости из пластика, стеклопластика, баки, бочки, септики, сантехника, насосы, монтаж»
Канализационные Емкости и резервуары (в дальнейшем КНС) устанавливают в сочетании с очистными сооружениями, в том случае если рельефные особенности местности не дают возможности выводить сточные воды самотёком. С целью перекачки атмосферных, промышленных и хозяйственных сточных вод, а также агрессивных и нефтесодержащих стоков, применяют КНС.
Корпус насосной станции изготовлен из композитного материала и обладает высокой износоустойчивостью, герметичностью, а также отличается долговечностью в эксплуатации. При необходимости и в зависимости от желаний заказчика, КНС могут быть укомплектованы насосами, шкафами управления (ШУ), площадками для обслуживания, лестницами и другим специальным оборудованием.
Общая конструкция и комплектация станции зависит от технического задания.
Комплектные канализационные насосные станции (КНС) из стеклопластика для отвода промышленных, хозяйственно-бытовых и ливневых сточных вод бывают нескольких видов:
-
Вертикальные
-
Горизонтальные
-
Сухого исполнения
-
С погружными насосами
-
Большого размера
-
Станции пожаротушения
-
Станции повышения давления
Вертикальные КНС.
Основой вертикальной установки КНС является стеклопластиковая емкость, исполненная в форме цилиндра. Корпус полностью герметичен, что позволяет гарантировать 100%-ную защиту от возможного попадания сточных вод в грунт, равно как и проникновение внутрь изделия грунтовых и других вод. Благодаря этому, вертикальная КНС полностью отвечает строгим требованиям экологической безопасности и может устанавливаться на участках с повышенными требованиями к сохранению здоровья людей.
Горизонтальные КНС.
Когда особенности рельефа местности не позволяют отводить сточные, ливневые воды самотёком, в систему очистных сооружений включают канализационные Емкости и резервуары (КНС). Перекачивание промышленных, атмосферных сточных вод, а также агрессивных или нефтесодержащих жидкостей берут на себя Емкости и резервуары. Принцип работы заключается в накапливании и перекачивании жидкостей до очистных сооружений на дальнейшую очистку.
На объектах с неравномерным поступлением сточных вод в систему очистных сооружений добавляют канализационные станции с горизонтальным заложением ёмкостей. Это позволяет аккумулировать залповый сброс атмосферных стоков, накапливать жидкость в резервуаре, и с помощью насосной системы перекачивать её далее по системе в штатном режиме. Особенностью горизонтальных КНС является работа в часы наименьшего потребления электричества, а также возможность избежать аварийных ситуаций во время пиковых нагрузок.
КНС сухого исполнения.
Канализационные Емкости и резервуары (в дальнейшем КНС) устанавливают в сочетании с очистными сооружениями, в том случае если рельефные особенности местности не дают возможности выводить сточные воды самотёком. С целью перекачки атмосферных, промышленных и хозяйственных сточных вод, а также агрессивных и нефтесодержащих стоков, применяют КНС.
Корпус насосной станции изготовлен из композитного материала и обладает высокой износоустойчивостью, герметичностью, а также отличается долговечностью в эксплуатации. При необходимости и в зависимости от желаний заказчика, КНС могут быть укомплектованы насосами, шкафами управления (ШУ), площадками для обслуживания, лестницами и другим специальным оборудованием. Общая конструкция и комплектация станции зависит от технического задания.
Особенности КНС сухого типа исполнения
КНС могут быть разных типов, что же касается станций высокой производительности, то чаще всего, их разделяют на два отсека: рабочий (куда поступает жидкость) и насосный.
Основную часть оборудования, в том числе насосы, располагают в сухом отсеке, доступ жидкости в который блокируется. Такой тип КНС называется сухого исполнения. Достичь подобного разделения, позволяет монтирование двух резервуаров, которые соединяют между собой всасывающими трубопроводами. При соединении используют эластичные элементы, способные предотвратить негативные напряжения от деформации или вибрации, и обеспечить общую стабильность конструкции.
КНС с погружными насосами.
Когда нет способа осуществить отвод производственных или ливневых стоков самотёком, применяют канализационные Емкости и резервуары (КНС). Это позволяет организовать отток жидкости, решить проблемы загрязнения окружающей среды, а главное, перенаправить сточные воды к очистным сооружениям.
КНС представляет собой погружённый в землю резервуар, внутри которого располагаются насосы и необходимое оборудование для перекачивания и фильтрации жидкости. Корпус резервуара изготавливают из композитных материалов, что позволяет добиться герметичности и долговечности всей конструкции при небольшом общем весе.
При необходимости перекачки нефтесодержащих и агрессивных жидкостей, корпус изготавливают из химически стойких материалов.
Установка насосного оборудования прямо под воду является основной особенностью КНС с погружными насосами. Все оборудование помещается в один резервуар, который погружают в грунт. Для того чтобы резервуар не поддавался воздействию грунтовых вод и прочих факторов, на дно котлована укладывают железобетонную плиту к которой крепиться основание резервуара.
КНС позволяет обеспечить перекачивание сточных вод используя 2 насоса в стандартной комплектации, которые крепят на дно отсека прямо в перекачиваемую среду. В верхней части располагаются станины и направляющие для насосов, а также крюки, используемые для демонтажа оборудования и закрепления датчиков. Доступ в отсек осуществляется через люк, расположенный над землей, а для удобства обслуживания внутри резервуара крепиться лестница.
КНС большого размера.
При необходимости обеспечения перекачки больших объёмов жидкости на крупных промышленных предприятиях, устанавливаются специально разработанные КНС под конкретные нужды большого размера.
КНС в таких случаях производят прямо на месте установки, производственные мощности компании позволяют собирать агрегаты до 30 м в диаметре. Учитывая количество перекачиваемой жидкости, подбирается соответствующее оборудование и разрабатывается индивидуальный проект конструкции.
Подбор режима перекачивания жидкости и установка необходимого шкафа управления, а также соответствующего программного обеспечения, позволяет настроить протекание процессов внутри КНС в автономном режиме. Для обслуживания насосных станций большого размера, чаще всего, устанавливаются специальные площадки сухого типа. Здесь могут располагаться все необходимые датчики, регулирующие вентили и ШУ, а также средства защиты и гигиены для персонала.
Обеспечение безопасности
Крупные предприятия обычно нуждаются в перекачивании большого количества агрессивных жидкостей на очистные сооружения, аварии в подобных условиях приводят к серьёзным последствиям. Поэтому шкафы управления КНС способны обеспечить одновременную работу насосов при пиковых нагрузках или аварийное автоматическое отключение неисправного агрегата, и ввод в работу другого.
Также в ШУ расположены автоматы защиты, способные предотвратить перегрузки электродвигателей насосов. КНС обладают множеством уровней защиты, что позволяет избежать аварийных ситуаций.
Станция насосного типа для систем пожаротушения.
Автоматические Емкости и резервуары пожаротушения нашли применение при организации надежной и эффективной защиты зданий, строений и сооружений различного типа от возможного возгорания. С этой целью, непосредственно в систему противопожарной защиты (ППЗ) включают станцию пожаротушения, обеспечивающую в автоматическом режиме подачу воды либо специального пенного раствора, с помощью которого производится непосредственное тушение очага возгорания.
С учетом выбранного типа запуска, Емкости и резервуары могут использоваться при работе в системах пожаротушения:
Дренчерная: здесь встроенная система контроля, а также используемая автоматика в круглосуточном режиме отслеживает состояние самой насосной станции, а при поступлении установленного сигнала о возникновении нештатной ситуации, немедленно производится запуск основного насоса и начинается поступление воды (пены).
Если по каким-либо причинам не запускается основной насос, работу системы обеспечивает резервный.
Спринклерная: в данном варианте техника отслеживает уровень давления, который должен поддерживаться в системе трубопроводов и оставаться неизменным. Запуск насосов производится немедленно после падения этого давления, а работу основного насоса контролирует жокей-насос. На «подстраховке» также находится и резервный насос, который также включается «на автомате» при отказе от работы двух предыдущих либо недостаточном уровне давления.
Станции повышения давления.
Емкости и резервуары повышения давления (сокращенно «СПД») компании - это современные системы, позволяющие регулировать и поддерживать давление в системе водоснабжения. Устанавливаются они непосредственно между источником воды и ее потребителем, управляются, как правило, дистанционно, работают в автоматическом заданном режиме и состоят из следующих основных частей:
-
2-6 насосов, установленных на цельной металлической раме;
-
аппаратуру управления, смонтированную в специальном шкафу;
-
арматуру, выполняющую запорно—регулирующие функции;
-
приборы и устройства автоматического контроля.
СДП фактически - это заданных размеров резервуар, изготовленный из стеклопластика, заглубленный в грунт. Внутри емкости размещается все оборудование и аппаратура, а для доступа к насосам повышения давления предусмотрено технологическое отверстие с люком, через которое осуществляется доступ специалистов для осмотра и технического обслуживания. Для эффективной и бесперебойной работы системы предусмотрено устройство освещения, вентиляции и, при необходимости, - отопления.
Преимущества комплектных КНС из стеклопластика
Традиционные канализационные насосные станции из монолитного или сборного железобетона, имеют ряд конструктивных недостатков, устранение которых в условиях растущих требований потребителей, резко повышает их стоимость и эксплуатационные затраты:
- большая себестоимость строительно-монтажных работ, сопровождаемая большим числом специальных мероприятий по обеспечению строительного цикла;
- необходимость в специальных дополнительных решениях по гидроизоляции, выполнение которых резко увеличивает стоимость сооружения и требует постоянного мониторинга состояния гидроизоляции;
- в случае неравномерных просадок сооружения или при внешних воздействиях, имеется риск возникновения трещин в конструкции, нарушении гидроизоляции и герметичности всей конструкции, что ведёт к дополнительным затратам у эксплуатирующей организации;
- в большинстве случаев КНС из железобетона экономически оправданы при строительстве насосных станций диаметром более 6,0 м и глубиной больше 12,0 м.
Канализационные насосные станции, выполненные из железобетона, находятся в чрезвычайно агрессивных для них условиях эксплуатации, где скорость коррозии достигает 25-40 мм/год и более, при содержании h3S в воздухе более 500 мг/м! Ведущим фактором коррозии в канализационных коллекторах является биологический. Подобные станции в 2/3 случаев подвержены коррозионным разрушениям, а в 1/3 случаев аварии вызваны физико-механическими воздействиями.
Сточные воды, содержащие более 1 мг/л сульфидов, являются потенциально агрессивными сточки зрения возникновения биологического фактора — образования сероводорода в воде, его дегазации в атмосферу сооружения и последующего окисления в серную кислоту, что также сказывается на сроке службы канализационных насосных станций.
Комплектные канализационные насосные станции, производства компании «ЭКОВОД» выполненные из композитного стеклопластика, в свою очередь, исключают появление перечисленных факторов риска.
Емкости из армированных стекловолокном полиэфирных смол являются инженерными сооружениями, выдерживающими наружные нагрузки (давление грунта и грунтовых вод) и вес от установленного оборудования. Композитный стеклопластик, полимерные материалы и нержавеющая сталь, применяемые при изготовлении КНС, не поддаются коррозии и гниению что исключает необходимость профилактических работ по коррозионной защите корпуса и обеспечивает эксплуатационный срок сооружений не менее 50 лет.
ФИЗИКО-МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПОЗИТНОГО СТЕКЛОПЛАСТИКА
Стеклопластик представляет собой композиционный материал, состоящий на 70% из стеклянных волокон, связанных между собой полиэфирными смолами. Связующее вещество придает материалу монолитность, способствует эффективному использованию механических свойств стеклянного волокна и равномерному распределению усилий между волокнами, защищает волокно от химических, атмосферных и других внешних воздействий.
Стеклопластик обладает высокой механической прочностью при относительно низком удельном весе, по физическим свойствам он приравнивается к легированной стали, а в отдельных случаях даже её превосходит.
Стеклопластик рассчитан на широкий диапазон рабочих температур (от −50° до + 110°С), что позволяет использовать его как в закрытых помещениях, так и на открытом воздухе. Стеклопластик — практически вечный материал, он не гниёт и не ржавеет, практически не стареет (в отличие от пластиков), не боится агрессивных жидкостей.
ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА СТЕКЛОПЛАСТИКА
Малый удельный вес
Удельный вес стеклопластика составляет в среднем 1,1 г/см3. Для сравнения: удельный вес стали − 7,8 г/см3, меди — 8,9 г/см3, дюралюминия — 2,8 г/см3. Из этого следует, что удельный вес стеклопластика в среднем в 5 — 6 раз меньше, чем у металлов и в два раза меньше, чем у дюралюминия.
Диэлектрические свойства
Стеклопластик является прекрасным электроизоляционным материалом при использовании как переменного, так и постоянного тока.
Высокая коррозионная стойкость
Стеклопластик как диэлектрик совершенно не подвергается электрохимической коррозии.
Он обладает водостойкостью и химостойкостью, а также стойкостью к различным агрессивным средам, в том числе и к воздействию концентрированных кислот и щелочей. Для стеклопластика характерно сочетание высоких показателей стойкости к атмосферным воздействиям.
Хороший внешний вид
Стеклопластик при изготовлении хорошо окрашивается в любой цвет и сохраняет его на протяжении длительного периода времени.
Высокие механические свойства
При своём небольшом удельном весе стеклопластик обладает высокими физико-химическими характеристиками, а по своим прочностным свойствам превосходит некоторые сплавы цветных металлов.
Теплоизоляционные свойства.
Стеклопластик относится к материалам с низкой теплопроводностью.
Конструкции из композитного стеклопластика во много раз превосходят срок службы аналогичных конструкций из ПВХ, стали и алюминия. Физико-технические качества стеклопластика обеспечивают безотказную работу изделий, изготовленных из этого материала, в течение 50 лет и более, без существенных затрат на эксплуатацию.
Технологические возможности работы КНС, выполненной из композитного стеклопластика:
- температура перекачиваемой жидкости: до +70°С;
- плотность жидкости: максимальная 1600 кг/м2;
- размер твердых частиц: до 80% размера проходного сечения насоса;
- рН перекачиваемой жидкости 6-11;
- глубина погружения насоса до 20 м;
- температурный диапазон окружающей среды: от −50°С до +40°С.
Канализационные насосные станции (КНС) | ООО Хан
Канализационные насосные станции (КНС) обеспечивают подачу сточных вод на очистные сооружения, если рельеф местности не позволяет отводить эти воды самотеком. Применение канализационных насосных станций (КНС) позволяет также избежать большого заглубления самотечных коллекторов.
Комплектные канализационные насосные станции
Строительство канализационных насосных станций (КНС) из сборного железобетона за последнее время резко сократилось.
В условиях плотной городской застройки масштабные земляные работы довольно трудны и дороги. Применение обычных методов строительства канализационных насосных станций (КНС) постепенно становится проблемным. Наиболее оптимальным решением для обеспечения перекачки бытовых, ливневых и промышленных вод является устройство небольших комплектных канализационных насосных станций (ККНС), выполненных из современных прочных материалов в том числе из стеклопластика.
Предлагаемые Вашему вниманию комплектные канализационные насосные станции (КНС) производства компании ООО «ЭКОВОД», представляют собой цилиндрическую емкость из армированного стеклопластика нанесенного по технологии машинной намотки, диаметром от 0,6 до 5,0 метров, вертикального или горизонтального типа и имеют абсолютную герметичность и высокую прочность. Высота корпуса, а, следовательно, и глубина заложения, достигает 7-10, а иногда 12 и более метров.
Канализационные насосные станции (КНС) полной заводской готовности, производительностью от 1 до 100 000 м3/час применяются в системах ливневой, производственной и хозяйственно-бытовой канализации для перекачки бытовых и поверхностных сточных вод, когда транспортировка жидкости самотеком невозможна. и являются полностью подземными. В канализационных насосных станциях (КНС) размещается насосное и вспомогательное оборудование: погружные насосы, внутренние трубопроводы, арматура, напорные патрубки. Станция комплектуется панелью управления. Канализационная насосная станция (КНС) выпускается без надземного здания, но по желанию заказчика, на заводе можно разработать и изготовить металлический сборный павильон из легких конструкций, в котором будут размещены: щит управления, вентиляционные и подъемно-транспортные устройства для эксплуатации и ремонта. Емкости из армированного стеклопластика являются инженерными сооружениями, выдерживающими наружные нагрузки (давление грунта, давление грунтовых вод) и вес от установленного в них технологического оборудования.
Эпоксидный и полиэфирный стеклопластик, специальные полимерные материалы и нержавеющая сталь, применяемые при изготовлении канализационной насосной станции (КНС) , не поддаются коррозии и гниению, и этим устраняется необходимость профилактических работ по противокоррозионной защите корпуса и обеспечивается длительный срок рабочей эксплуатации сооружений - не менее 50 лет.
Расчет канализационных насосных станций (КНС) производится специалистами компании ЭКОВОД в соответствии с заполненным техническим заданием Заказчика.
Корпус и днище канализационных насосных станций (КНС) выполняется из армированных стекловолокном полиэфирных смол. Горловина канализационных насосных станций (КНС) оборудована решеткой безопасности и закрыта крышкой. Во внутреннюю часть емкости через стенку выведена гильза для трубопровода подачи стоков. Напротив самотечного коллектора устраивается специальная сороулавливающая корзина из нержавеющей стали, которая необходима для устранения из воды крупных механических включений, позволяя увеличить срок службы насосного оборудования.
В стандартном исполнении в канализационных насосных станций (КНС) производства ЭКОВОД устанавливается от 1 до 10 (при необходимости и более) насосных агрегатов «погружной/сухой» установки производства компаний Flygt (Швеция), Grundfos (Германия), ОДО «Взлет» (Россия) и других производителей. Насосы крепятся на напорном патрубке без болтовых соединений посредством собственного веса и скользящего захватного устройства с возможностью вертикального перемещения по направляющим. Это значительно облегчает монтаж/демонтаж и техническое обслуживание самих насосных агрегатов. Напорные патрубки насосов закреплены на усиленном металлическими пластинами основании из многослойного стеклопластика. От каждого насоса идет напорный трубопровод, на котором установлены шаровой обратный клапан и клиновая механическая задвижка. Система внутренних трубопроводов выполнена из нержавеющей стали. Для удобства обслуживания канализационные насосные станции (КНС) оборудуются лестницей и системой вентиляции.
Режим вентиляции осуществляется с помощью вентиляционных труб, выходящих на поверхность и исключающих возможность скопления газов в резервуаре. Крепление канализационных насосных станций (КНС) к плите основания производится анкерными болтами с пластиной. КНС оборудуются кабельными вводами, транспортировочными петлями, утеплением крышки люка. Внутри канализационных насосных станций (КНС) на специальном держателе развешиваются поплавковые датчики уровня включения/отключения насосов: поплавок общего отключения, пуска насосов и подачи аварийного сигнала. Поплавки и насосы подключены к шкафу управления. Работа насосов осуществляется в автоматическом режиме посредством сигналов от поплавковых датчиков уровня.
Преимущества комплектных канализационных насосных станци из стеклопластика перед железобетонными насосными станциями
Традиционные насосные станции из монолитного или сборного железобетона, имеют ряд конструктивных недостатков, устранение которых в условиях растущих требований потребителей, резко повышает их стоимость и эксплуатационные затраты:
- Большая себестоимость строительно-монтажных работ, сопровождаемая большим числом специальных мероприятий по обеспечению строительного цикла;
- Необходимость в специальных дополнительных решениях по гидроизоляции, выполнение которых резко увеличивает стоимость сооружения и требует постоянного мониторинга состояния гидроизоляции
- В случае неравномерных просадок сооружения или при внешних воздействиях, имеется риск возникновения трещин в конструкции, нарушении гидроизоляции и герметичности всей конструкции, что ведёт к дополнительным затратам у эксплуатирующей организации
- В большинстве случаев станции из железобетона экономически оправданы при строительстве насосных станций диаметром более 6,0 м и глубиной больше 12,0 м
Также канализационные насосные станции (КНС), выполненные из железобетона находятся в чрезвычайно агрессивных для них условиях эксплуатации, где скорость коррозии достигает 25-40 и более мм/год, при содержании Н2S в воздухе более 500 мг/м3.
Ведущим фактором коррозии в канализационных коллекторах является биологический. Подобные станции в 67% случаев подвержены коррозионным разрушениям. В 33% случаев аварии вызваны физико-механическими воздействиями.
Сточные воды, содержащие более 1 мг/л сульфидов, являются потенциально агрессивными с точки зрения возникновения биологического фактора - образования сероводорода в воде, его дегазации в атмосферу сооружения и последующего окисления в серную кислоту, что также сказывается на сроке службы канализационных насосных станций.
Комплектные канализационные насосные станции, выполненные из стеклопластика, в свою очередь, исключают появление перечисленных факторов риска.
Стеклопластик представляет собой композиционный материал, состоящий на 70% из стеклянных волокон, связанных между собой полиэфирными смолами. Связующее вещество придает материалу монолитность, способствует эффективному использованию механических свойств стеклянного волокна и равномерному распределению усилий между волокнами, защищает волокно от химических, атмосферных и других внешних воздействий.
Стеклопластик обладает высокой механической прочностью при относительно низком удельном весе, по физическим свойствам он приравнивается к легированной стали, а в отдельных случаях даже её превосходит. Стеклопластик рассчитан на широкий диапазон рабочих температур (от -50° до + 110°С), что позволяет использовать его как в закрытых помещениях, так и на открытом воздухе. Стеклопластик - практически вечный материал, он не гниет и не ржавеет, практически не стареет (в отличие от пластиков), не боится агрессивных жидкостей.
Основные свойства стеклопластика
Малый удельный вес. Удельный вес стеклопластика колеблется от 0,4 до 1,8 и в среднем составляет 1,1г/см3. Для сравнения: удельный вес стали - 7,8 г/см3, меди - 8,9 г/см3, дюралюминия -2,8 г/см3. Мы видим, что дельный вес стеклопластика в среднем в пять-шесть раз меньше, чем у черных и цветных металлов, и в два раза меньше, чем у дюралюминия.
Диэлектрические свойства. Стеклопластик является прекрасным электроизоляционным материалом при использовании как переменного, так и постоянного тока.
Высокая коррозионная стойкость. Стеклопластик как диэлектрик совершенно не подвергается электрохимической коррозии. Он обладает стойкостью к различным агрессивным средам, в том числе и к воздействию концентрированных кислот и щелочей. Для стеклопластика характерно сочетание высоких показателей стойкости к атмосферным воздействиям, водостойкости и химической стойкости.
Хороший внешний вид. Стеклопластик при изготовлении хорошо окрашивается в любой цвет и может сохранять его неограниченно долго.
Высокие механические свойства. При своем небольшом удельном весе стеклопластик обладает высокими физико-механическими характеристиками, а по своим прочностным свойствам превосходит некоторые сплавы цветных металлов и стали.
Теплоизоляционные свойства. Стеклопластик относится к материалам с низкой теплопроводностью.
Конструкции из стеклопластика во много раз превосходят срок службы аналогичных конструкций из ПВХ, стали, алюминия. Физико-технические качества стеклопластика обеспечивают безотказную работу изделий, изготовленных из этого материала, в течение 50 лет и более, без существенных затрат на эксплуатацию.
Технологические возможности работы КНС, выполненной из стеклопластика:
- температура перекачиваемой жидкости: до 40°С
- плотность жидкости: максимальная 1100 кг/м2
- размер твердых частиц: до 80% размера проходного сечения насоса.
- рН перекачиваемой жидкости: 6-11
- глубина погружения насоса: до 20 м.
- температурный диапазон окружающей среды: от -25°С до +40°С
Принцип работы комплектной канализационной насосной станции
В работе комплектной канализационной насосной станции (КНС) производства ЭКОВОД предусмотрены три режима:
Режим № 1 (нормальная работа):
Сточные воды по самотечному коллектору поступают в канализационную насосную станцию (КНС).
Происходит ее наполнение до уровня срабатывания поплавка включения одного из насосов. В нормальном режиме насос откачивает поступившую воду, и отключается, когда она спадет до уровня срабатывания поплавка общего отключения насосов.
Режим № 2 (нормальная работа/пиковая нагрузка):
Сточные воды по самотечному коллектору поступаю в комплектную канализационную насосную станцию (ККНС). Происходит ее наполнение до уровня срабатывания поплавка включения одного из насосов. Если этот насос не справляется с объемом поступающей воды (пиковая нагрузка), и она доходит до уровня срабатывания поплавка включения второго агрегата, то включается в работу другой насос. В этом режиме оба насоса откачивают поступающую воду и отключаются, когда она спадет до уровня срабатывания поплавка общего отключения насосов.
Режим № 3 (нормальная работа/пиковая нагрузка/экстренная ситуация):
Сточные воды по самотечному коллектору поступают в комплектную канализационную насосную станцию (ККНС).
Происходит ее наполнение до уровня срабатывания поплавка включения одного из насосов. Если этот насос не справляется с объемом поступающей воды (пиковая нагрузка), и она доходит до уровня срабатывания поплавка включения второго агрегата, то включается в работу другой насос. Если же оба насоса не справляются с поступающей водой, или они не включились от сигналов поплавков, то происходит наполнение емкости до уровня срабатывания поплавка подачи аварийного сигнала.
При срабатывании этого поплавка происходит следующее:
- подается дублирующий сигнал на повторное включение обоих насосов,
- подается аварийный сигнал на шкаф управления.
В качестве аварийного сигнализатора может использоваться сигнальное устройство типа сирена или проблесковый маячок, а также их комбинация. Отключение насосов происходит, когда откачиваемая вода достигает уровня срабатывания поплавка общего отключения насосов.
В приложениях представлены чертежи дейcтвующих канализационных насосных станций (КНС) с колодцами регулирования и насосным оборудованием различной производительности.
Также включение аварийной сигнализации может произойти в случае:
- неправильной последовательности фаз,
- опасности затопления,
- перегрузки,
- перегрева (датчик РТС или термовыключатель),
- неисправности поплавкового выключателя, электрода или реле расхода,
- сухого хода.
Для обслуживания и ремонта насосов, или их замены используются направляющие для подъема насосов до крышки канализационной насосной станции (КНС). Подъем насосов осуществляется либо вручную, либо с помощью подъемных механизмов.
Панель управления служит для контроля, управления и защиты насосов, использующихся в системах канализации, дренажа и водоснабжения. На панели могут быть установлены: термоподогрев, амперметры, счетчик стартов, вольтметр с фазным переключателем и т.д.
Принцип монтажа комплектной канализационной насосной станции (КНС)
Комплектная канализационная насосная станция (ККНС) устанавливается на специально рассчитанную бетонную плиту с целью обеспечения фиксированного положения под землей и воспрепятствования подъему на поверхность в результате возникающей в воде выталкивающей силы. Если уровень грунтовых вод находится вровень с поверхностью земли, то сила выталкивания равна объему комплектной канализационной насосной станции (ККНС). ККНС крепится к плите основания при помощи установленных на одинаковом расстоянии друг от друга не поддающихся коррозии анкерных болтов с пластинами. При анкеровке комплектной канализационной насосной станции (ККНС) необходимо учитывать все потенциальные риски, которые могут обусловить подъем емкости на поверхность (уровень грунтовых вод, сток дождевой воды, аварийные затопления, нестабильная почва и пр.) Вес плиты и тяжесть заполняющего грунта, влияющая на плиту основания, обеспечивают фиксированное положение комплектной канализационной насосной станции (ККНС) под землей. Бетонная плита основания должна быть не менее 200 мм в толщину. Длина и ширина плиты должна превышать диаметр насосной не менее чем на 600 мм. Если грунт очень нестабилен, то лучше расширить плиту основания до краев котлована или отлить более толстую бетонную плиту.
Дно котлована заполняется по всей длине резервуара горизонтальным слоем песка и гравия толщиной 300 мм. Затем на дно котлована укладывается железобетонная плита основания. Комплектная канализационная насосная станция (ККНС) устанавливается на находящуюся на дне котлована бетонную плиту. Через отверстия, расположенные во фланцевом выступе комплектной канализационной насосной станции (ККНС) сверлятся отверстия в плите. Через эти отверстия устанавливаются анкерные болты с пластинами и происходит закрепление станции на плите основания.
После этого пространство вокруг комплектной канализационной насосной станции (ККНС) заполняется слоями песка в 500 мм, постоянно их уплотняя. Плотность обратной засыпки должна быть не менее 1500 кг/м3. Когда обратная засыпка дойдет до фитингов труб, осуществляются необходимые соединения, уплотняются трубы и продолжается заполнение котлована слоями по 500 мм до проектного уровня.
Если комплектная канализационная насосная станция (ККНС) устанавливается в зоне озеленения, необходимо следить, чтобы люк был выше поверхности земли не менее чем на 100 мм. Это будет препятствовать нежелательному попаданию осадочных вод в насосную станцию. Подсоединение труб выполняется по заполнению котлована до подводящего коллектора. Завалка и утрамбовка грунта ниже этой отметки особенно важна. Затем в гильзу корпуса комплектной канализационной насосной станции (ККНС) заводят трубу подводящего коллектора. Получившийся зазор между гильзой ККНС и самотечным коллектором герметизируют строительной паклей с раствором саморасширяющегося цемента (ГОСТ 110552-74).
Далее продолжается обратная засыпка и уплотнение грунта до отметки напорного трубопровода. К напорному трубопроводу присоединяется напорный выход из комплектной канализационной насосной станции (ККНС). Обратная засыпка осуществляется равномерно вокруг ККНС мягким грунтом без включения камней, для того, чтобы исключить повреждение корпуса. На последнем этапе монтируется панель управления в предварительно выбранном для этого месте на открытом воздухе или в помещении. Затем устанавливаются и подключаются насосы, вывешиваются поплавковые регуляторы уровня. После проведения пуско-наладочных работ станция готова к работе.
Подбор комплектной канализационной насосной станции (КНС)
Подбор комплектной канализационной насосной станции (ККНС) определяется: глубиной заложения подводящего коллектора; объемом сточных вод, поступающих на ККНС; видом перекачиваемой жидкости; гидрогеологическими условиями строительства; типом устанавливаемых насосных агрегатов и способом их управления. По роду перекачиваемой жидкости насосные станции водоотведения делятся на четыре группы: для перекачивания бытовых сточных вод, атмосферных (ливневых) вод, производственных сточных вод, осадков образующихся на очистных сооружениях.
К насосным станциям перекачивающим производственные стоки, предъявляется ряд требований, учитывающих агрессивность сточной жидкости. Также необходимо производить периодические промывки станции чистой водой. Насосные станции для транспортировки осадков находятся в едином комплексе сооружений очистки сточной жидкости и обработки осадков. Они служат для перекачки сброшенного осадка и активного ила на сооружения для дальнейшей их обработки.
Канализационные насосные станции. КНС
Комплектная насосная станция поставляется Заказчику в полностью готовом и укомплектованном виде, что значительно упрощает монтаж и значительно сокращает сроки по вводу оборудования в эксплуатацию.
Габаритные размеры КНС и технические характеристики насосного оборудования зависят от:
объема перекачиваемых стоков
высоты подъема
диаметра и длины напорного коллектора
глубины заложения подводящего коллектора
КНС представляет собой корпус цилиндрической формы, выполненный методом машинной намотки (радиальной или перекрестной) с утепленным люком, внутренним напорным трубопроводом расчетного диаметра с запорно-регулирующей арматурой, сферическим дном, корзиной для сбора крупного мусора/отбойником, стеклопластиковой лестницей и откидной площадкой обслуживания.
Проектирование комплектных насосных станций
При проектировании и расчете насосных станций необходимо учитывать особенности ландшафта конкретного объекта, режимы работы, объем и вид перекачиваемых стоков. В зависимости от сложности и масштабов, сроки, отведенные на проектирование насосных станций, могут варьироваться. Особенно важен правильный подбор насосных агрегатов и параметров корпуса станции, так как в случае ошибки велика вероятность сокращения сроков службы установки.
Комплектные канализационные насосные станции могут иметь следующее оснащение:
-насосы со встроенным поплавковым выключателем, который автоматически срабатывает при наполнении и опорожнении резервуара КНС
-насосы с дублирующим автоматическим включением и подачей сигнала аварии внешнему оператору
-насосы (рабочие и резервные), срабатывающие от независимых поплавковых выключателей, причем резервный насос автоматически включается при несрабатывании рабочего насоса
устройства для учета расхода воды и т.д.
МОНТАЖ КНС
Правильное выполнение строительно-монтажных работ имеет не менее важное значение чем проектирование и должно проводиться высококвалифицированным персоналом, имеющим опыт в проведении монтажных работ подземных сооружений.
Монтаж КНС выполняется в строгом соответствии с рекомендациями завода изготовителя, описанных в паспорте на изделие и руководстве по эксплуатации.
Узнать дополнительную информацию, подобрать оборудование, подать заявку на проектирование и монтаж КНС Вы можете, связавшись с менеджерами нашей компании.
И помните, правильный подбор оборудования и качественно проведенный монтаж - это залог долговечной и бесперебойной работы всего комплекса сооружений!
ОПИСАНИЕ
Канализационная насосная станция выпускается в полной заводской готовности и может монтироваться и подключаться на объекте сразу после доставки. Канализационная станция представляет собой стеклопластиковый корпус, выполненный методом машинной намотки (радиальным или перекрестным способом), со смонтированной системой трубопроводов, запорной арматурой и элементами обслуживания (люк, лестница, подвесная площадка и т.д.). Канализационная насосная станция комплектуется погружными или самовсасывающими насосами (Wilo (Германия) (мы являемся оффициальными дилерами Wilo)) или других производителей - по требованию Заказчика.
Управление насосами осуществляется посредством поплавковых или ультразвуковых датчиков и щита управления, который монтируется на отдельной раме вблизи канализационной насосной станции (наружное исполнение шкафа управления) или в ближайшем здании (внутреннее исполнение шкафа управления).
ВИДЫ КНС
КНС подземного исполнения с погружными насосами (классический вариант)
Классическая КНС Насосная Станция состоит из:
-Стеклопластикового корпуса, выполненного методом машинной намотки.
-Для спуска и подъема в корпусе устанавливается лестница, выполненная из стеклопластика (по требованию заказчика выполняется из нержавеющей стали).
-В случае если длина корпуса КНС более 3 метров, в корпусе устанавливается промежуточная площадка, так называемая площадка обслуживания, с помощью которой персонал может обслужить запорную арматуру.
-На вводе подводящей трубы устанавливается корзина для сбора мусора или отбойник, выполненные из стеклопластика (по требованию заказчика выполняются из нержавеющей стали). Корзина имеет возможность подъема наверх для опорожнения (направляющими для подъема является лестница).
-Одним из основных элементов в конструкции КНС является САТМ, так называемая Система Автоматической Трубной Муфты, которая позволяет монтировать/демонтировать насос в автоматическом режиме, то есть при монтаже отсутствует необходимость обслуживающему персоналу спускаться в корпус Насосной Станции
-Внутренний напорный трубопровод выполняется из нержавеющей стали с установленной запорной арматурой.
КНС с погружными насосами под проезжей частью.
При необходимости размещения КНС под проезжую часть, применяются корпуса в классическом исполнении с конструктивным изменением - наличие одной или нескольких горловин диаметром 600 мм, под стандартный чугунный люк.
Данное исполнение предусматривает наличие разгрузочной плиты над канализационной насосной станцией. Толщина плиты рассчитывается проектной организацией в зависимости от типа проезжей части и расчетных нагрузок.
КНС подземного исполнения с погружными насосами и павильоном обслуживания
Данный вариант используется в тех случаях, когда:
-требуется визуальный контроль/поиск насосной станции. Например, установка КНС в месте, удаленном от населенного пункта.
-требуется наличие стационарной тали для монтажа/демонтажа насосов.
-необходимо обеспечить дополнительное утепление (промерзание земли идет под углом 45% от края наземного павильона к корпусу КНС).
комплектация в предложении
Эти примеры взяты из корпусов и из источников в Интернете. Любые мнения в примерах не отражают мнение редакторов Cambridge Dictionary, Cambridge University Press или его лицензиаров.
Эти преобразования различаются в зависимости от интерпретации полного набора предпочтений.
С каждым новым решением пользователь получает лучшее приближение к , полный набор .
На этот раз мы расширяем количество возмущений непосредственно с точки зрения полного набора функций.
Кроме того, было оформлено два заказа на презентацию комплекта комплект карточек.
Полный набор данных не был собран для всех ячеек для всех временных частот.
Поэтому предлагается более полный набор смешанных инструментов, который решает эти проблемы.
Однако расширение скопления и более полных набора финансовых инструментов вводят новые идеи.
Кроме того, предоставляется полный набор отчетов, подготовленных в ходе проверки.
Для этого нужен полный набор однокубитных и двухкубитных вентилей.
Полный комплект скриптов и выходных файлов доступен у авторов.
С помощью подсчета можно сделать вывод, что у нас есть полных набор представителей.
Поскольку знания бесконечны, невозможно будет сгенерировать полных наборов правил.
Такая система не имеет конечного и полного набора аксиом.
Полный набор антисывороток содержал сыворотки пула, типа, группы и фактора.
Комплект Набор мог быть выпущен на четырех компакт-дисках без разделения пиршества между сторонами.
Геномика относится к картированию, секвенированию и анализу полных набора генов и хромосом в организмах.
Попытка объяснить полный набор выводов может ошеломить обычного пользователя.
Профилирование с использованием стеков центров затрат позволяет регистрировать полный набор программных затрат.
Но в комплекте всегда есть хотя бы одна применимая диаграмма.
С таким же успехом можно было бы использовать абстрактную интерпретацию для вывода информации из менее полных набора аннотаций.
Уравнения (20), (22) и (23) образуют полный набор уравнений, описывающих распространение микроволнового импульса в самогенерируемой плазме.
Кроме того, большинство реальных доменов настолько сложны, что предоставление полного набора правил непрактично или невозможно.
В идеале каждый должен предоставлять полный набор информации, которая будет понятна, если текст будет удален.
Следовательно, не следует категорически требовать включения полного набора экологических соглашений в каждую программу адаптации.
Каждый поток генератора является единственным ответственным за полное использование своей подцели и получение полного набора ответов.
Эти примеры взяты из корпусов и из источников в Интернете. Любые мнения в примерах не отражают мнение редакторов Cambridge Dictionary, Cambridge University Press или его лицензиаров.
Callaway Big Bertha REVA, комплект из 11 предметов
Меню Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клубы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Мячи для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Механизм Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женский гольф Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Таможня Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Установка Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Видео Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Подкасты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Заголовки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сообщество Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюг / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Одиссея Клюшки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Юниоры / Комплекты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женский Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Левша Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Оформление Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт Х Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт X LS Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации E • R • C Мягкий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Супер мягкий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сверхмягкий МАКС Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Очень горячий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Warbird Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Трувис Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации REVA Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Страта Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Головной убор Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Перчатки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Путешествовать Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Головные уборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Курсовая экипировка Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Очки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Оформление Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Подарочные карты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские водители Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женщины, Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские утюги / комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские туфли на танкетке Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские комплекты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Пользовательские клубы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Персонализированные мячи для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Ограниченные аукционы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Инструкция Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Продукт Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Тур Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюги / комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Полные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюги / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки на подставке Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для тележек Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для персонала Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для кэдди Закрыть меню навигации
Поиск Закрыть меню навигации
Глобальный.header.account.title Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Счет Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Авторизоваться Закрыть меню навигации
Callaway Big Bertha REVA, комплект из 8 предметов
Меню Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клубы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Мячи для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Механизм Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женский гольф Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Таможня Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Установка Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Видео Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Подкасты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Заголовки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сообщество Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюг / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Одиссея Клюшки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Юниоры / Комплекты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женский Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Левша Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Оформление Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт Х Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт X LS Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации E • R • C Мягкий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Супер мягкий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сверхмягкий МАКС Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Очень горячий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Warbird Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Трувис Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации REVA Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Страта Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Головной убор Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Перчатки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Путешествовать Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Головные уборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Курсовая экипировка Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Очки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Оформление Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Подарочные карты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские водители Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женщины, Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские утюги / комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские туфли на танкетке Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские комплекты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Пользовательские клубы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Персонализированные мячи для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Ограниченные аукционы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Инструкция Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Продукт Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Тур Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюги / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Полные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюги / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки на подставке Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для тележек Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для персонала Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для кэдди Закрыть меню навигации
Поиск Закрыть меню навигации
Глобальный.header.account.title Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Счет Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Авторизоваться Закрыть меню навигации
Callaway Golf XT Набор из 10 предметов для подростков
Меню Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клубы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Мячи для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Механизм Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женский гольф Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Таможня Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Установка Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Видео Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Подкасты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Заголовки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сообщество Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюг / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Одиссея Клюшки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Юниоры / Комплекты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женский Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Левша Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Оформление Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт Х Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Хром Софт X LS Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации E • R • C Мягкий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Супер мягкий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сверхмягкий МАКС Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Очень горячий Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Warbird Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Трувис Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации REVA Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Страта Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Головной убор Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Перчатки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Путешествовать Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Головные уборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Курсовая экипировка Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Очки Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Оформление Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Подарочные карты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские водители Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женщины, Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские утюги / комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские туфли на танкетке Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Женские комплекты Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Пользовательские клубы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Персонализированные мячи для гольфа Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Ограниченные аукционы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Инструкция Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Продукт Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Тур Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюги / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Полные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Драйверы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Fairway Woods Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Утюги / Комбинированные наборы Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Гибриды Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Клинья Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки на подставке Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для тележек Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для персонала Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Сумки для кэдди Закрыть меню навигации
Поиск Закрыть меню навигации
Глобальный.header.account.title Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Счет Закрыть меню навигации
Вернуться к предыдущему меню навигации Авторизоваться Закрыть меню навигации
Мужской профиль SGI Полный комплект для гольфа - Carry
- Запатентованная Wilson система "Custom fit in a box" ™ имеет тринадцать вариантов размеров, подходящих для любого игрока!
- Большой драйвер объемом 460 куб. См. Разработан с использованием технологии Super Game Improvement, чтобы улучшить новые впечатления от игры в гольф
- Глубокие, утяжеленные по периметру 431 утюги из нержавеющей стали с очень низким центром тяжести для повышения точности и расстояния
- Легкая сумка премиум-класса с регулируемым плечом Air Flow ™ ремни, прочная верхняя часть ручки, множество карманов и самоактивирующаяся подставка
- "Easy Launch" ™ Sand Wedge отличается очень низким весом и широкой подошвой для лучшего контроля над травой и улучшенного броска
- Популярная клюшка с утяжелением пятки и носка с мягким захватом обеспечивает превосходную обратную связь , ощущение и точность
- Древесина фервея высокого старта и легкость попадания Гибридная технология заменяет длинные утюги
- Материал головных уборов премиум-класса с фланелевой подкладкой и мягкими всепогодными захватами
DRIVER Кованый титановый композит увеличенного размера 460 куб.см. Драйвер с технологией силового взвешивания.
Большое лицо в зоне наилучшего восприятия Водитель с более прочным чердаком для большего расстояния.
FAIRWAY WOOD Большой деревянный фервей для зоны наилучшего восприятия с графитовым стержнем, усиленным наконечником, и всепогодной рукояткой. Прочный лофт и конструкция с низким весом позволяют играть как на фервее, так и на грубых трассах.
HYBRID Гибридная клюшка, легкая в попадание, с неглубокой головкой и высокой технологией взлета.
Усовершенствованная конструкция головки обеспечивает лучшую траекторию, чем длинные удилища из труднодоступных мест, что приводит к более длинным и прямым выстрелам.
УТЮГИ Мощные утюги из нержавеющей стали с очень низким центром тяжести, облегчающие запуск мяча. Чрезвычайно утяжеление по периметру создает огромную золотую середину для повышения точности даже при попаданиях вне центра.
Технология «Large Unsupported Face» для увеличения скорости мяча и увеличения расстояния!
ПЕСОЧНЫЙ КЛИН Дизайн улучшения игры помогает запускать мяч из бункера.
Сверхмалый вес и очень широкая подошва прорезают песок для большего контроля.
PUTTER Популярная клюшка с утяжелением пятки и носка с устойчивостью головы и технологией выравнивания.
Изолированная зона наилучшего восприятия для лучшего ощущения и точности
ЧЕХЛЫ ДЛЯ ГОЛОВЫ Популярные чехлы для головы премиум-класса защищают ваши ценные вложения.
Мягкая фланелевая подкладка предохраняет древесину и гибридное лакокрасочное покрытие от повреждений.
СУМКА ДЛЯ ПЕРЕНОСКИ С РУЧКОЙ Прочная и легкая самоактивирующаяся сумка на стойке с просторными карманами для хранения. Мягкая семиступенчатая подкладка с удобной подъемной ручкой защищает графитовые валы для продолжительной работы. Эргономичные двойные лямки повышают комфорт во время движения и снимают усталость.
ПЛЕЧЕВОЙ РЕМЕНЬ AIRFLOW ™ Удобный сетчатый ремешок поверх мягкой шестигранной сердцевины способствует циркуляции воздуха и обеспечивает комфорт.
Полный набор клонов ORF библиотеки ASKA Escherichia coli (Полный набор архивов ORF E. coli K -12): Уникальные ресурсы для биологических исследований | Исследование ДНК
Абстрактные
Основываясь на данных геномной последовательности штамма Escherichia coli K-12, мы сконструировали полный набор клонированных индивидуальных генов, кодирующих гистидин-меченые белки с или без GFP, слитые для функционального геномного анализа.Каждый клон кодирует белок предсказанной ORF, присоединенный гистидинами, и семь аминокислот-спейсеров на N-конце, и пять аминокислот-спейсеров и GFP на C-конце. Сайты рестрикции Sfi I генерируются как на N-, так и на C-концевых границах ORF при клонировании, что позволяет легко переносить ORF в другие векторные системы путем разрезания Sfi I. Экспрессия клонированной ORF находится под контролем индуцируемый IPTG промотор, который строго репрессируется продуктом гена репрессора lacI q .Набор клонированных ORF, описанный здесь, должен предоставить уникальные ресурсы для систематических функциональных геномных подходов, включая (i) конструирование ДНК-микрочипов, (ii) производство и очистку белков, (iii) анализ локализации белка путем мониторинга флуоресценции GFP и (iv) анализ. белок-белкового взаимодействия.
1. Введение
Более 200 полных геномных последовательностей микробов теперь доступны из общедоступных баз данных, таких как DDBJ в Национальном институте генетики (веб-страница авторов), GenBank в Национальном центре биотехнологической информации (веб-страница авторов) и EMBL-EBI в Европейском институте биоинформатики (Веб-страница автора).1 Среди них две прокариоты, грамположительная бактерия Bacillus subtilis и грамотрицательная бактерия Escherichia coli , а также одноклеточный эукариот Saccharomyces cerevisiae широко использовались в качестве модельных организмов для фундаментальных биологических исследований. 2–4 Полная последовательность генома показала, что, хотя эти микроорганизмы относятся к числу наиболее тщательно изученных генетических систем, экспериментально охарактеризовано менее 50% их соответствующих генов.Данные о последовательностях генома являются ценными ресурсами не только для информации, дополняющей традиционные биологические подходы, но и для разработки новых подходов, известных как «функциональная геномика», области исследований компьютерного анализа полных геномов с последующей экспериментальной проверкой возникающих гипотез. 5, 6
Информация о последовательности генома проливает новый свет на природу и взаимосвязь между бактериальными генами, включая предки, семейства генов, модули и мотивы в сравнительных терминах.7–9 Сравнение хромосомного положения генов внутри и между видами может также выявить аспекты эволюции генома и функционального сцепления между генами. 10–12 Подробная информация о структуре и функциях генома и, в частности, отдельных генных продуктов является наиболее обширной и всеобъемлющей для E. coli , и примерно половина генных продуктов была охарактеризована с использованием различных генетических, биохимических и молекулярно-биологические методы. На основе обширных данных, полученных в результате этого анализа, гены с известной функцией были разделены на несколько отдельных категорий.13 Важность генома E. coli как ведущей модельной системы, кажется, быстро получила признание для будущих исследований функциональной геномики и системной биологии.
Однако для дальнейшего прояснения природы генов с неизвестной функцией были бы особенно полезны различные ресурсы, такие как отдельные клонированные гены, деструктивные или делеционные мутанты для каждого из предсказанных генов. Полные данные о последовательности генома позволили построить такие ресурсы для Mycoplasma genitalium , Bacillus subtilis и Saccharomyces cerevisiae .14–17 Конструирование полногеномных клонов в E. coli имеет долгую историю, включая плазмидные клоны, 18 космидных библиотек, 19–21 и клоны лямбда фага. 22, 23
Кроме того, в последнее время накапливается все большее количество белков, называемых «подрабатывающими белками», выполняющих две или более различных функций. 24 Таким образом, это будет хорошей возможностью для переоценки сообщаемой функции известных генов и изучения новой функции с использованием крупномасштабных ресурсов, таких как клонированные гены, указанные здесь, а также делеции и другие мутанты.
Здесь мы описываем полный набор клонов генов Escherichia coli , который должен позволить нам проводить систематический функциональный анализ не только генов с неизвестной функцией, но и генов с известной функцией, чтобы изучить их функцию. Каждую из предсказанных ORF, кроме стартового и стоп-кодонов, амплифицировали с помощью ПЦР с последующим клонированием в многокопийный плазмидный вектор. Каждый продукт помечен гистидином на своем N-конце, а GFP слит на его C-конце. Экспрессия клонированных генов направляется промотором P T5- lac , который может быть активирован IPTG, но обычно репрессируется lacI q , помещенным в цис .
2. Материалы и методы
2.1. Штаммы и условия роста
E. coli K-12, штамм AG1 [ recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 ( r K - m K + ) rel supE44 Эффективность трансформации, приобретенная у Stratagene, Inc., была использована для всех экспериментов по конструированию плазмид и других экспериментов.
Клетки обычно выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) [1% бакто-триптон (BD Diagnostic Systems), 0.5% дрожжевой экстракт (BD Diagnostic Systems), 0,5% NaCl], содержащий 50 мкг / мл ампициллина (Meiji Seika Kaisha, Ltd), 30 мкг / мл канамицина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd) или хлорамфеникол (Nacalai Tesque, Inc. .) как требуется. Изопропил-β-d-тиогалактозид (IPTG) использовали в концентрации 0,1 мМ для индукции экспрессии клонированного гена.
2.2. Праймеры для ПЦР
Пара праймеров для ПЦР была сконструирована для амплификации каждой из предсказанных ORF E. coli , которая начинается со второго кодона до последнего аминокислотного кодона, минуя кодоны инициации и терминации.Каждый праймер содержит 3 или 2 дополнительных основания на 5'-конце, за которыми следуют 20 или 21 основание ORF-специфической последовательности для N- или C-конца, соответственно. Дополнительные нуклеотиды были включены для облегчения направленного клонирования и создания сайтов рестрикции Sfi I. Таким образом, все N-концевые праймеры имеют последовательность 5'-GCC (20N) -3 ', где 20N специфична для каждой ORF, начинающейся со второго кодона. Точно так же все С-концевые праймеры имеют последовательность 5 '- (21N) CC-3', где 21N специфична для каждой ORF, оканчивающейся последним аминокислотным кодоном.Полученный в результате фрагмент ПЦР имеет последовательность от 5'-GCC-2 до аминокислотного кодона -GG-3 '. Все праймеры фосфорилировали перед использованием в реакции ПЦР.
В следующих особых случаях последовательности праймеров были модифицированы для обхода случайной генерации сайтов рестрикции Sfi I. (i) Если последовательность ORF окажется ATG NNN NNG GCC N… .N NNN GGC CNN NNN TAA, амплифицированный с помощью ПЦР фрагмент будет GCC NNN NNG GCC N… .N NNN GGC CNN NNN GG и полученная плазмида после клонирование будет иметь последовательность «… GGCCCTGAG (GGCC NNN NNG GCC) N….N NNN GGC CNN NNN (GGCC TATGCGGCC)… ’, генерирующий дополнительные сайты Sfi I (подчеркнуты) помимо этих на периферии (в скобках). Чтобы избежать этого осложнения, остаток G третьего кодона NNG был заменен соответствующим остатком без изменения кодируемой аминокислоты, а третий остаток последнего аминокислотного кодона был изменен с GGC на GGT.
Если третий остаток последнего аминокислотного кодона представляет собой G, а последовательность ORF - «ATG NN… .NN NNG TAA», то амплифицированный с помощью ПЦР фрагмент будет иметь последовательность «GCC ATG NN…».NN NNG GG ’, и этот фрагмент имеет сайт Sfi I, даже если последний остаток G был неожиданно удален экзонуклеазной активностью, загрязненной полимеразой или рестрикционным ферментом. Чтобы избежать этого, последний аминокислотный кодон был заменен синонимичным кодоном, в котором отсутствует G у третьего остатка. Однако, когда последним кодоном был Met (ATG) или Trp (TGG), никаких изменений не производилось из-за отсутствия синонимичного кодона done.
2.3. ПЦР-амплификация
Реакцию амплификации ПЦРпроводили в 96-луночных планшетах.Чтобы свести к минимуму ошибки ПЦР во время амплификации, 1 ед. ДНК-полимеразы KOD (TOYOBO CO., Ltd.) использовали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 20–30 нг ДНК клона фага Kohara или геномной ДНК E. coli , по 1,0 мкМ каждой праймер и 200 мкМ дНТФ. Использовали рекомбинантную форму ДНК-полимеразы Thermococcus kodakaraensis KOD, имеющую 3 '→ 5'-зависимую от экзонуклеазу корректирующую активность и проявляющую очень высокую точность. 25, 26. Реакции были выполнены в соответствии с инструкциями производителя, и амплифицированные фрагменты были затуплены с помощью полимеразы KOD.Реакции ПЦР проводили в 25 циклах при 95 ° C в течение 15 секунд, 64 ° C в течение 15 секунд, 72 ° C в течение 4 минут с последующей последней инкубацией при 72 ° C в течение 5 минут. Все реакции выполнялись автоматическим реакционным роботом для секвенирования PRIZM877 (Applied BioSystems), чтобы избежать ошибок, возникающих из-за ручного управления.
Около 99% ORF (4217) могут быть успешно амплифицированы ДНК-полимеразой KOD; многие из неудачных ORF имели размер> 2 т.п.н., и большинство из них (~ 90%) можно было амплифицировать с помощью DynaZyme (Finzymes Oy). Остальные ORF (~ 1% от общего количества) могут быть получены с использованием ДНК-полимеразы LATaq (TAKARA BIO, Inc.).
2.4. Очистка ПЦР фрагмента
Все продукты ПЦР очищали электрофорезом в агарозном геле (0,7–1,5% гель) в 1 × ТАЕ буфере в зависимости от длины амплифицированных фрагментов. Гели окрашивали SyberGOLD (Molecular Probes, Inc.) и визуализировали светом 480 нм, чтобы минимизировать повреждение ДНК. Затем изображения были сфотографированы и проверены на их размер. Продукты ПЦР ожидаемого размера вырезали и элюировали с помощью MagExtractor (TOYOBO Co., Ltd) в соответствии с инструкциями производителя.
2.5. Клонирование индивидуальных ORF в вектор pCA24N
фрагментов ДНК, очищенных электрофорезом в агарозном геле, индивидуально лигировали с ДНК вектора pCA24N, которая была расщеплена Stu I и дефосфорилирована. Лигирование проводили в течение 1 ч при 16 ° C с использованием набора для лигирования (TAKARA BIO, Inc.). Лигированную ДНК осаждали этанолом, промывали 70% этанолом, сушили в вакууме и ресуспендировали в 10 мкл H 2 О. Раствор ДНК (1 мкл) использовали для электротрансформации, отбирая устойчивость к хлорамфениколу на пластине LB.Компетентные клетки (50 мкл), приготовленные в соответствии с лабораторными руководствами 27, смешивали с 1 мкл раствора ДНК в ледяной 0,2-см кювете (Bio-Rad Laboratories, Inc.), обрабатывали при 2,5 кВ с помощью 25 мФ и 200 Ом. с последующим добавлением 1 мл среды SOC (2% бакто триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 , 10 мМ MgSO 4 , 20 мМ глюкозы). Затем клетки переносили в каждую из 96 отформатированных глубоких лунок и оставляли для восстановления в течение 1 ч при 37 ° C при встряхивании при 250 об.вечера. перед нанесением на селективную среду.
2.6. Подтверждение структуры клонов ORF
Плазмидные клоныочищали с помощью набора для очистки 96-луночной плазмидной ДНК в формате Multi Screen (Millipore Corporation), и их структуру подтверждали расщеплением ферментом рестрикции Bgl I или Sfi I и исследованием с помощью электрофореза в агарозном геле. Клоны с ожидаемым гелеобразным рисунком далее анализировали прямым секвенированием продуктов, амплифицированных ПЦР, полученных с использованием праймера pCA-F 5'-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACC-3 'и праймера pCA-R3 5'-TTGCATCACCTTCACCCTCTCCACTGACAG-3'.Праймеры, используемые для секвенирования, представляли собой праймер F-CA 5'-CATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGG-3 'со стороны, меченной His, и праймер R-CA 5'-CATCTAATTCAACAAGAATTGGGACAACTC-3' со стороны GFP. Реакцию секвенирования проводили с использованием модели ABI PRISM 377, 3700 или 3730 в соответствии со стандартным протоколом Big-dye (Applied BioSystems).
2.7. Флуоресценция GFP
Колонии образовывались на чашках LB, содержащих 30 мкг / мл хлорамфеникола с (1 мМ) или без IPTG. Флуоресценцию GFP отдельных колоний визуализировали светом 480 нм и фотографировали с помощью IMAGE FREEZER AE-6905 (ATTO CORPORATION).
2,8. Очистка белка
Клетки, продуцирующие меченный гистидином белок из клона, выращивали при 37 ° C в 5 мл среды LB с добавлением 30 мкг / мл хлорамфеникола до OD 600 0,3. Образцы отбирали через 2 часа после добавления 1 мМ IPTG. Клетки собирали центрифугированием (10000 об / мин × 3 мин при 4 ° C) и ресуспендировали в 400 мкл холодного буфера I [50 мМ фосфат натрия (pH 7,0), 200 мМ NaCl, ингибитор протеиназы (Hoffmann-La Roche Ltd). ].После этого все манипуляции проводили при 4 ° C. Неочищенные экстракты клеток получали обработкой ультразвуком (5 × 5 с, уровень 3, ультразвуковой процессор Astrason) и центрифугированием (16 000 об / мин × 15 мин). Неочищенные клеточные экстракты загружали на 30 мкл никелевой (Ni 2+ ) -колонки [приготовленной в соответствии с инструкциями производителя (QIAGEN, Inc) и уравновешенной буфером I]. Аффинную хроматографию экстрактов проводили при 4 ° C. Загруженные колонки трижды промывали 1 мл буфера 2 [Буфер I содержит 20 мМ имидазола и 0.05% n -октил-β-глюкозид (Pierce Biotechnology, Inc)] и белки элюировали буфером 3 [50 мМ Трис-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерина, 100%. мМ ДТТ, 6 М мочевина и 250 мМ имидазол]. Элюированные белки анализировали с помощью SDS – PAGE с градиентом 7,5–15% (BIOCRAFT Co., Ltd.) с последующим окрашиванием кумасси бриллиантовым синим.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Конструирование клонирующего вектора pCA24N
Чтобы клонировать все гены Escherichia coli , мы сконструировали плазмидный вектор со следующими свойствами: (i) плазмида с высоким числом копий, (ii) IPTG-индуцируемая экспрессия клонированной ORF репрессия экспрессии lacI q , (iii) гистидиновый тег, прикрепленный к N-концевому концу ORF, (iv) слияние в рамке считывания с GFP на C-конце, (v) создание сайтов рестрикции Sfi I на обеих границах клонированной ORF ( Инжир.1) (см. Ниже). Конструкция pCA24N схематически показана на рис.2. Экспрессия целевой ORF, вставленной в сайт Stu I, направляется IPTG-индуцибельным промотором, P T5- lac . Каждая ORF сливается в рамке считывания с аминокислотами спейсера Histidine tag 7 на N-конце (фиг. 3).
Рисунок 1
Создание сайтов Sfi I путем клонирования целевой ORF только в правильном направлении. Верхняя строка - сайт клонирования pCA24N.Для клонирования целевой рамки считывания в сайт Stu I (заштриховано) вставляли область, кодирующую белок с тупым концом ПЦР-амплифицированный с тремя (GCC) и двумя (GG) дополнительными нуклеотидами на N- и C-конце соответственно. треугольник). Лигирование тупоконечного 5'-GCCXXX… XXXGG-3 'фрагмента (X указывает нуклеотиды целевого гена) генерирует сайтов Sfi I на обеих границах фрагмента, когда лигирование было выполнено в правильном направлении (слева), но не в противоположном направление (вправо). Открытые стрелки показывают фрагменты, амплифицированные с помощью ПЦР, а острие стрелки указывает направление ORF.
Рисунок 1
Создание сайтов Sfi I путем клонирования целевой ORF только в правильном направлении. Верхняя строка - сайт клонирования pCA24N. Для клонирования целевой рамки считывания в сайт Stu I (заштриховано) вставляли область, кодирующую белок с тупым концом ПЦР-амплифицированный с тремя (GCC) и двумя (GG) дополнительными нуклеотидами на N- и C-конце соответственно. треугольник). Лигирование тупоконечного 5'-GCCXXX… XXXGG-3 'фрагмента (X указывает нуклеотиды целевого гена) генерирует сайтов Sfi I на обеих границах фрагмента, когда лигирование было выполнено в правильном направлении (слева), но не в противоположном направление (вправо).Открытые стрелки показывают фрагменты, амплифицированные с помощью ПЦР, а острие стрелки указывает направление ORF.
Рисунок 2
Конструкция вектора. Фрагмент Bam HI и Sac I pQB2, 39 размером 4,1 т.п.н. с тупым концом лигировали с фрагментом устойчивости к канамицину ( kan ), который был амплифицирован из pHSG299, 40 с использованием праймеров олиго ДНК: 5'- CGGCCCTGAGGCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCG-3 'и 5'-GGCCATATAGGCCTGAATGGCGAATGCGATTTATTC-3' для создания pQA2-Km.Для получения фрагмента, имеющего lacI q и терминатор, pGEX-2TK, 41 был переварен Aat II и Eam I и заканчивался тупым концом. Полученный фрагмент lacI q лигировали с фрагментом устойчивости к хлорамфениколу Bam HI pNK2884, 42 с тупыми концами для создания pCX2TK1. Тупоконечный Aat II и Nhe I фрагмент pQA2-Km и Sma I– Fsp I тупоконечный фрагмент лигировали для создания pCA21.Исходный GFP является термолабильным и имеет слабую флуоресценцию или ее отсутствие при температуре 37 ° C или выше. Чтобы заменить исходный GFP на теплостойкую мутантную форму, фрагмент Stu I– Sma I pCA21 лигировали с амплифицированным с помощью ПЦР фрагментом GFP из pGFPgcn4, 28 с помощью праймеров олиго ДНК, имеющих сайт рестрикции Not I: 5 ′ -CCTATGCGGCCGCAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3 ′ и 5′-TTAGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3 ′. Not I сайтов обоих праймеров были разработаны для удаления GFP после клонирования.Ориджин репликации и гистидиновая метка полученного вектора, названного pCA24N, были получены из pGEX-2TK и pQE31 (родительская плазмида pQB2) соответственно.
Рисунок 2
Построение вектора. Фрагмент Bam HI и Sac I pQB2, 39 размером 4,1 т.п.н. с тупым концом лигировали с фрагментом устойчивости к канамицину ( kan ), который был амплифицирован из pHSG299, 40 с использованием праймеров олиго ДНК: 5'- CGGCCCTGAGGCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCG-3 'и 5'-GGCCATATAGGCCTGAATGGCGAATGCGATTTATTC-3' для создания pQA2-Km.Для получения фрагмента, имеющего lacI q и терминатор, pGEX-2TK, 41 был переварен Aat II и Eam I и заканчивался тупым концом. Полученный фрагмент lacI q лигировали с фрагментом устойчивости к хлорамфениколу Bam HI pNK2884, 42 с тупыми концами для создания pCX2TK1. Тупоконечный Aat II и Nhe I фрагмент pQA2-Km и Sma I– Fsp I тупоконечный фрагмент лигировали для создания pCA21.Исходный GFP является термолабильным и имеет слабую флуоресценцию или ее отсутствие при температуре 37 ° C или выше. Чтобы заменить исходный GFP на теплостойкую мутантную форму, фрагмент Stu I– Sma I pCA21 лигировали с амплифицированным с помощью ПЦР фрагментом GFP из pGFPgcn4, 28 с помощью праймеров олиго ДНК, имеющих сайт рестрикции Not I: 5 ′ -CCTATGCGGCCGCAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3 ′ и 5′-TTAGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3 ′. Not I сайтов обоих праймеров были разработаны для удаления GFP после клонирования.Ориджин репликации и гистидиновая метка полученного вектора, названного pCA24N, были получены из pGEX-2TK и pQE31 (родительская плазмида pQB2) соответственно.
Фигура 3
Предсказанные аминокислотные последовательности около N- и C-концевых областей клонированной открытой рамки считывания. Стрелка указывает на целевую ORF и пару праймеров, используемых для ПЦР-амплификации. Нижние нуклеотидные и аминокислотные последовательности указывают на предсказанную окончательную структуру вокруг сайта клонированной ORF.Белки-продукты должны содержать 6 гистидин, 7 и 5 аминокислот на N- и C-концах целевого гена, соответственно, за которыми следует фрагмент GFP: 6xHisThrAspProAlaLeuArgAlaXXX… XXXGlyLeuCysGlyArg… GFP, где XXX… XXX указывает на предпоследнюю аминокислоту. кислотный кодон целевого гена.
Фигура 3
Предсказанные аминокислотные последовательности около N- и C-концевых областей клонированной ORF. Стрелка указывает на целевую ORF и пару праймеров, используемых для ПЦР-амплификации.Нижние нуклеотидные и аминокислотные последовательности указывают на предсказанную окончательную структуру вокруг сайта клонированной ORF. Белки-продукты должны содержать 6 гистидин, 7 и 5 аминокислот на N- и C-концах целевого гена, соответственно, за которыми следует фрагмент GFP: 6xHisThrAspProAlaLeuArgAlaXXX… XXXGlyLeuCysGlyArg… GFP, где XXX… XXX указывает на предпоследнюю аминокислоту. кислотный кодон целевого гена.
Ген, кодирующий мутантную форму GFP 28, помещали сразу после ORF для получения слитого белка.Это в основном предназначено для определения локализации белкового продукта в клетке-хозяине. GFP также должен был служить индикатором правильного клонирования амплифицированной ДНК ORF. Однако он был разработан для удаления ORF после удаления GFP путем расщепления ферментом Not I с последующим самолигированием. Окончательная структура клонированной ORF после удаления GFP показана на фиг. 4. Клоны, которые имеют сайт (ы) рестрикции Not I в ORF, могут быть получены отдельно с использованием частичного переваривания ферментом Not I.
Рисунок 4
Удаление фрагмента GFP при расщеплении Not I. Каждый клон ORF имеет два сайта Not I, один в области C-концевого спейсера (в пределах Sfi I # 2) и область непосредственно рядом с кодоном терминации гена GFP. Таким образом, GFP может быть удален путем переваривания Not I с последующим самолигированием.
Рисунок 4
Удаление фрагмента GFP при расщеплении Not I.Каждый клон ORF имеет два сайта Not I, один в области C-концевого спейсера (в пределах Sfi I # 2) и область непосредственно рядом с кодоном терминации гена GFP. Таким образом, GFP может быть удален путем переваривания Not I с последующим самолигированием.
3.2. Клонирование в pCA24N
Число ORF, использованных в качестве исходного целевого клонирования, составило 4276, исключая ORF, закодированные элементами IS. Большинство из них (4267 из 4276 ORF) были успешно клонированы в pCA24N в кадре и в правильной ориентации: 3 из 9 неудачных ORF, yhcQ , yibP и aidB , вероятно, могли быть клонированы только в противоположном направлении. потому что даже небольшая утечка экспрессии из промотора P T5- lac или вышележащей области токсична для клетки-хозяина.Оставшиеся шесть ORF, eaeH (7104 bp), yheB (2694 bp), yhiH (2685 bp), yagF (1968 bp), ydbD (2313 bp) и btuB ), не удалось амплифицировать с помощью реакции ПЦР отчасти из-за их длины для амплификации. Сообщалось, что мРНК btuB образует сложную структуру для контроля связывания с рибосомой и ее трансляции. 29 Это может помешать амплификации с помощью реакции ПЦР.
Очищенные ПЦР-амплифицированные фрагменты затем лигировали в сайт StuI вектора pCA24N.После инкубации в течение ночи при 37 ° C восемь колоний отбирали для каждой ORF и суспендировали в 1 мл свежей среды LB в 96 форматированных глубоких лунках, а также наносили штрихами на планшеты с 1 мМ IPTG, содержащие LB, при 37 ° C для проверки в рамке. клонирование путем наблюдения за ростом и флуоресценцией GFP при избыточном производстве слитого белка GFP, кодируемого каждой ORF. После инкубации в течение ночи при 37 ° C плазмидную ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора для очистки ДНК Multi Screen, расщепляли рестрикционными ферментами Sfi I или Bgl I и анализировали электрофорезом в агарозном геле.Были выбраны четыре независимых клона, которые имеют ожидаемые структуры, и сохранены в виде смеси ДНК, чтобы минимизировать потерю внутренней генетической информации во время амплификации ПЦР. Границы сайтов клонирования подтверждали секвенированием.
3.3. Подавление роста индукцией IPTG
Чтобы исследовать влияние избыточного предложения продуктов целевого гена, мы индуцировали экспрессию ORF путем выращивания участков клеток на агаровой среде LB с добавлением или без 1 мМ IPTG при 37 ° C.Из 4269 протестированных ORF 3301 ORF показали некоторые эффекты ингибирования роста за счет индукции IPTG (фиг. 5). Из этих ORF 2149 ORF показали серьезные дефекты роста: было предсказано, что 1158 ORF имеют мембранный домен и являются мембранными белками. Из 1158 вероятных мембранных белков 1032 ORF показали серьезные дефекты роста при избыточном продуцировании.
Рисунок 5
Влияние на рост и флуоресценцию GFP за счет индукции IPTG. Эффекты роста при индукции 1 мМ IPTG на чашке с агаром LB при 37 ° C были разделены на три категории.Цифры представляют собой отношение каждой из классифицированных ORF к общему количеству ORF E. coli .
Рисунок 5
Влияние на рост и флуоресценцию GFP за счет индукции IPTG. Эффекты роста при индукции 1 мМ IPTG на чашке с агаром LB при 37 ° C были разделены на три категории. Цифры представляют собой отношение каждой из классифицированных ORF к общему количеству ORF E. coli .
3.4. Использование клонов ORF
Создание микрочипа ДНК
Во-первых, мы попытались сконструировать микроматрицу кДНК, используя клоны ORF в качестве ДНК-матриц для ПЦР-амплификации.Эти клоны не только функционируют в качестве матриц для ПЦР-амплификации с помощью одного набора общих праймеров олиго-ДНК для каждой целевой рамки считывания, но также, как обнаружено, служат в качестве подходящего источника для матрицы ДНК и обеспечивают стабильную поставку фрагмента ДНК. ДНК-микрочип E.coli теперь коммерчески доступен от TAKARA BIO, Inc. Приложения, использующие эти микроматрицы, уже опубликованы. 30–34
Производство очищенного протеина
Настоящий вектор был разработан как эффективный вектор экспрессии, и белковый продукт каждого клона может быть легко индуцирован IPTG в определенном количестве и очищен с использованием колонки Ni- или Co-NTA (рис.6). Некоторые белки, особенно большинство мембранных белков, трудно очистить этим методом. Немногочисленные цитозольные белки показали аналогичные трудности при очистке. Одна возможность состоит в том, что His-tag не может функционировать из-за N-концевой 3D-структуры. Также следует учитывать белки His-tag, присоединенные к его C-концу. Эти очищенные белки также являются хорошим источником для дальнейшего анализа, такого как биохимия белков, кристаллография и антигены для производства антител. Кроме того, анализ совместно очищенных белков с клонированной ORF, меченной His, может выявить кандидатов на взаимодействие белков.Этот анализ с использованием масс-спектрометрии для эффективной идентификации взаимодействующих белков в настоящее время проводится систематически.
Рисунок 6
Очистка белка с использованием колонки Ni-NTA после индукции IPTG. Плазмиды, используемые для сверхэкспрессии белков, меченных гистидином, были из библиотеки ASKA. Из 3 мл культуры, индуцированной добавлением 0,1 мМ IPTG в течение 2 ч, His-меченные белки очищали на колонке Ni-NTA. Все элюированные белки анализировали с помощью SDS-PAGE и визуализировали с помощью кумасси бриллиантового синего.Некоторые белки (CodB, SucC и SucD) практически не очищались этим методом.
Рисунок 6
Очистка белка с использованием колонки Ni-NTA после индукции IPTG. Плазмиды, используемые для сверхэкспрессии белков, меченных гистидином, были из библиотеки ASKA. Из 3 мл культуры, индуцированной добавлением 0,1 мМ IPTG в течение 2 ч, His-меченные белки очищали на колонке Ni-NTA. Все элюированные белки анализировали с помощью SDS-PAGE и визуализировали с помощью кумасси бриллиантового синего. Некоторые белки (CodB, SucC и SucD) практически не очищались этим методом.
Локализация белка определяется по флуоресценции GFP
Локализация белка, несомненно, является одной из важных сведений о белковом продукте для понимания его функции. Однако при индуцировании добавлением IPTG 62% всех клонов ORF показали ингибирование роста клетки-хозяина. И в некоторых случаях индукция IPTG может привести к образованию тельца включения. Чтобы избежать этих искусственных эффектов, клетки выращивали без IPTG. вектор pCA24N имеет lacI q для строгого подавления экспрессии промотора P T5- lac без условий роста IPTG; однако очень небольшая часть клеток показала флуоресценцию от GFP, вероятно, из-за утечки экспрессии.После пилотных испытаний с использованием клонов, известных своей клеточной локализацией, этот анализ был проведен на систематической стадии (Ники, Х., личное общение и любезно предоставленные изображения, рис. 7).
Рисунок 7
Изображение флуоресценции GFP клетки. Эти изображения клеток, имеющих ген ftsZ и codB наших клонов, были получены камерой CCD без какой-либо индукции путем добавления IPTG. Флуоресценция GFP возникает из-за утечки транскрипции с промотора.Результат согласуется с предыдущим наблюдением. 43 Фотографии были любезно предоставлены доктором Ники, Национальный институт генетики, Мисима, Япония.
Рисунок 7
Изображение флуоресценции GFP клетки. Эти изображения клеток, имеющих ген ftsZ и codB наших клонов, были получены камерой CCD без какой-либо индукции путем добавления IPTG. Флуоресценция GFP возникает из-за утечки транскрипции с промотора. Результат согласуется с предыдущим наблюдением.43 Фотографии были любезно предоставлены доктором Ники, Национальный институт генетики, Мисима, Япония.
Функциональный анализ ORF
Делеционная мутация целевого гена может выявить его физиологическую функцию из-за потери функции, но клон может также дать нам много предположений о его функции из-за избыточного предложения продукта целевого гена. Приложения с использованием клонов уже опубликованы в других местах. 35–38
3.5. Распространение клонов
Клонынаходятся в свободном доступе для использования в академических целях с соглашением о передаче материалов и планируются к распространению с нескольких сайтов в Японии и других странах.Первоначально эти клоны доступны в Институте науки и технологий Нара, и запросы принимаются через нашу веб-страницу (веб-страница авторов).
3.6. Контроль качества и сопутствующая информация
Исправить предсказание ORF не только для функциональной аннотации, но и для кодирующей области на основе последовательности генома - сложная проблема, и она всегда находится на стадии развития. Чтобы улучшить качество нашей библиотеки клонов плазмид, мы продолжаем попытки воссоздать целевые клоны ORF на основе последнего предсказания ORF.
В ноябре 2003 года аннотация генов E. coli международным консорциумом была начата в соответствии с корректировкой последовательности генома E. coli японской группой, организованной Хориучи (Hayashi, K., Morooka, N., Otsubo, E. et al., Рукопись готовится). Недавно консорциум зафиксировал более точное предсказание и аннотацию ORF в качестве первой версии (Riley, M. et al., Рукопись готовится). Общее количество ORF или фрагментов ORF E.coli K-12 W3110 составляет 4364. Из 4364 ORF, 77 были предсказаны как псевдогены, вызванные вставкой IS или мутацией сдвига рамки считывания. За исключением этих псевдогенов и IS или связанных с фагом ORF, необходимо создать 3986 вновь назначенных ORF в виде плазмидных клонов в качестве библиотеки ASKA. Согласно этой информации, мы обнаружили, что в нашей библиотеке требуется около 900 плазмидных клонов, которые необходимы для незначительной модификации в основном на их стартовых сайтах, и почти все они уже модифицированы и готовы к использованию. В то же время мы попытались прочитать всю последовательность клонированного фрагмента, чтобы проверить ошибку ПЦР и сохранить один правильный клон, если он доступен.
Как упоминалось в разделе «Материалы и методы», предыдущие запасы клонов представляют собой смесь от нескольких до четырех независимых кандидатов каждой целевой рамки считывания, структура которых была подтверждена рестрикционным ферментом и секвенированием с обеих сторон. Некоторые из них могут иметь ошибки ПЦР, и мы продолжим усилия по устранению таких ошибок путем секвенирования и повторного клонирования. Самая свежая информация о библиотеке АСКА доступна на нашей веб-странице (веб-страница авторов).
Эта работа была поддержана грантом на научные исследования в приоритетных областях Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии, грантом CREST, JST (Япония, наука и технологии) и частично от NEDO (Организация по развитию новой энергии и промышленных технологий) и Фонда Инамори.Мы благодарим Hironori Niki (Национальный институт генетики) за предоставленные фотографии локализации белка. Мы также благодарим Такаши Юру, Кацуми Исоно (Университет Кобе) и Такаши Хориучи (Институт фундаментальной биологии) за подготовку рукописи. Средства на оплату публикации этой статьи в открытом доступе были предоставлены NEDO.
Список литературы
1`` и др.Beyond 100 genomes
,Genome Biol.
,2003
, т.4
стр.402
2`` и др.Полная последовательность генома грамположительной бактерии Bacillus subtilis
,Nature
,1997
, vol.390
(стр.249
-256
) 3`` и др.Полная последовательность генома Escherichia coli K-12
,Science
,1997
, vol.277
(стр.1453
-1474
) 4`` и др.Обзор генома дрожжей
,Nature
,1997
, vol.387
(стр.7
-65
) 5`` и др.Анализ области гомологии кластера 103 т.п.н. с левого конца Saccharomyces cerevisiae хромосомы I
,Геном
,1997
, vol.40
(стр.151
-164
) 6,.Функциональная геномика и эволюция ферментов. Гомологические и аналогичные ферменты, закодированные в микробных геномах
,Genetica
,1999
, vol.106
(стр.159
-170
) 7,.Генные продукты Escherichia coli : сравнение последовательностей и общие предки
,Mol. Биол. Evol.
,1995
, т.12
(стр.980
-987
) 8,,.Геномный взгляд на семейства белков
,Science
,1997
, vol.278
(стр.631
-637
) 9,.Эволюция белка через последовательностей белков Escherichia coli : введение понятия структурного сегмента гомологии, модуль
,J.Мол. Биол.
,1997
, т.268
(стр.857
-868
) 10,.Предложение о механизме эволюции генома Escherichia coli
,Proc. Natl Acad. Sci. США
,1975
, т.72
(стр.1354
-1358
) 11`` и др.Использование кластеров генов для вывода функционального сцепления
,Proc. Natl Acad. Sci. США
,1999
, т.96
(стр.2896
-2901
) 12.MBGD: база данных микробного генома для сравнительного анализа
,Nucleic Acids Res.
,2003
, т.31
(стр.58
-62
) 13.Функции продуктов гена Escherichia coli
,Microbiol. Ред.
,1993
, т.57
(стр.862
-952
) 14`` и др.Глобальный мутагенез транспозонов и минимальный геном Mycoplasma
,Science
,1999
, vol.286
(стр.2165
-2169
) 15`` и др.Essential Bacillus subtilis гены
,Proc. Natl Acad. Sci. США
,2003
, т.100
(стр.4678
-4683
) 16`` и др.Функциональная характеристика генома S. cerevisiae с помощью делеции гена и параллельного анализа
,Science
,1999
, vol.285
(стр.901
-906
) 17,.Масштабный мутагенез: генетика дрожжей в эпоху генома
,Curr. Opin. Biotechnol.
,2001
, т.12
(стр.28
-34
) 18,,, et al.Корреляция подмножества плазмид pLC с физической картой Escherichia coli K-12
,Microbiol. Ред.
,1992
, т.56
(стр.137
-151
) 19,,, et al.Построение упорядоченной коллекции космид Escherichia coli K-12 W3110 хромосомы
,J.Бактериол.
,1989
, т.171
(стр.1214
-1218
) 20,,.Завершение подробной рестрикционной карты генома E. coli путем выделения перекрывающихся космидных клонов
,Nucleic Acids Res.
,1989
, т.17
(стр.5901
-5912
) 21,.Космидная карта штамма E. coli BHB2600 по сравнению с картой штамма W3110
,Nucleic Acids Res.
,1989
, т.17
(стр.5057
-5069
) 22,,.Физическая карта всей хромосомы E. coli : применение новой стратегии быстрого анализа и сортировки большой геномной библиотеки
,Cell
,1987
, vol.50
(стр.495
-508
) 23,.Картирование с использованием энциклопедий генов
,Nature
,1987
, vol.325
(стр.831
-832
) 24.Лунные белки
,Trends Biochem. Sci.
,1999
, т.24
(стр.8
-11
) 25`` и др.Длинная и точная ПЦР со смесью ДНК-полимеразы KOD и ее мутантного фермента, дефицитного по экзонуклеазе.
,J. Biotechnol.
,2001
, т.88
(стр.141
-149
) 26`` и др.Характеристика ДНК-полимеразы из Pyrococcus sp .штамм KOD1 и его применение для ПЦР
,заявл. Environ. Microbiol.
,1997
, т.63
(стр.4504
-4510
) 27,,. ,Molecular Cloning: A Laboratory Manual
,1998
2nd Ed.Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк
Лаборатория Колд-Спринг-Харбор
28,,.Новый мутант зеленого флуоресцентного белка с повышенной чувствительностью для микроанализа при возбуждении 488 нм
,Biochem. Биофиз.Res. Commun.
,1999
, т.264
(стр.556
-560
) 29,,, et al.Генетический контроль с помощью мРНК, связывающей метаболит
,Chem. Биол.
,2002
, т.9
стр.1043
30`` и др.Транскриптомный анализ всех двухкомпонентных мутантов регуляторной системы Escherichia coli K-12
,Mol. Microbiol.
,2002
, т.46
(стр.281
-291
) 31`` и др.Полногеномный анализ опосредованного дезоксиаденозинметилтрансферазой контроля экспрессии генов в Escherichia coli
,Mol. Microbiol.
,2002
, т.45
(стр.673
-695
) 32`` и др.HemK, класс протеинметилтрансфераз, сходных с ДНК-метилтрансферазами, метилирует факторы высвобождения полипептидной цепи, а нокаут hemK вызывает дефекты терминации трансляции
,Proc.Natl Acad. Sci. США
,2002
, т.99
(стр.1473
-1478
) 33`` и др.Амплификация горячих сегментов ДНК в Escherichia coli
,Мол. Microbiol.
,2002
, т.45
(стр.1575
-1588
) 34`` и др.Идентификация и молекулярная характеристика стимула Mg 2+ Escherichia coli
,J. Bacteriol.
,2003
, т.185
(стр.3696
-3702
) 35`` и др.Молекулярная характеристика последовательностей длинных прямых повторов (LDR), экспрессирующих стабильную мРНК, кодирующую 35-аминокислотный убивающий клетки пептид и цис-кодируемую малую антисмысловую РНК в Escherichia coli
,Mol. Microbiol.
,2002
, т.45
(стр.333
-349
) 36,,, et al.Идентификация и функциональный анализ Escherichia coli десульфгидразы цистеина
,Прил.Environ. Microbiol.
,2005
, т.71
(стр.4149
-4152
) 37,,, et al.Идентификация двух отсутствующих бактериальных генов, участвующих в спасении тиамина: тиаминпирофосфокиназа и тиаминкиназа
,J. Bacteriol.
,2004
, т.186
(стр.3660
-3662
) 38`` и др.Общие ферментативные скрининги идентифицируют три новых нуклеотидазы в Escherichia coli .Биохимическая характеристика SurE, YfbR и YjjG
,J. Biol. Chem.
,2004
, т.279
(стр.54687
-54694
) 39`` и др.Новая мутация, усиливающая флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка при высоких температурах
,Biochem. Биофиз. Res. Commun.
,1997
, т.232
(стр.69
-73
) 40`` и др.Плазмидные векторы с высоким и низким числом копий для lacZ альфа-комплементации и селекции устойчивости к хлорамфениколу или канамицину
,Gene
,1987
, vol.61
(стр.63
-74
) 41,.Одностадийная очистка полипептидов, экспрессируемых в Escherichia coli в виде слияния с глутатион-S-трансферазой
,Gene
,1988
, vol.67
(стр.31
-40
) 42,,.Использование транспозонов с акцентом на Tn10
,Методы Enzymol.
,1991
, т.204
(стр.139
-180
) 43,,.Совместная локализация белков деления клеток FtsZ и FtsA в структурах цитоскелета в живых клетках Escherichia coli с использованием зеленого флуоресцентного белка
,Proc. Natl Acad. Sci. США
,1996
, т.93
(стр.12998
-13003
)Заметки автора
© Автор 2006. Kazusa DNA Research Institute
Онлайн-версия этой статьи была опубликована в рамках модели открытого доступа.Пользователи имеют право использовать, воспроизводить, распространять или демонстрировать версию этой статьи в открытом доступе в некоммерческих целях при условии, что: исходное авторство правильно и полностью указано; Журнал и Издательство Оксфордского университета указываются как место первоначальной публикации с указанием правильных сведений о цитировании; если статья впоследствии воспроизводится или распространяется не полностью, а только частично или как производная работа, это должно быть четко указано. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь в журналы[email protected]
Полный набор хайлайтера космической эры - макияж Kaleidos
Межзвездный отпуск для ощущений на вершине оптического великолепия. Это созвездие пропитанных солнцем, меняющих цвет хайлайтеров здесь, чтобы направить вас в роскошное путешествие к вашей самой сияющей сущности. Сияйте ярко, как звезды, с набором маркера Space Age Highlighter.
Основные характеристики:
- Чрезвычайно яркие, меняющие цвет оттенки.
- Полупрозрачная, но отражающая многоцветная отделка.
- Сверхлегкая, гладкая текстура, которая практически тает на вашей коже.
- Универсальный; могут быть наложены на слои для еще большего многомерного эффекта.
- Подходит для всех оттенков кожи.
- Веганство и без жестокости.
The Space Age Prophecy: Мультихромный хайлайтер цвета шампанского со сверхъестественным зеленым оттенком и оттенком фуксии. Созданная для максимального освещения, эта меняющая цвет глазурь - тот избранный, которого так ждала вселенная.Выполните пророчество и откройте для себя царство сияния, когда вы соприкоснетесь с этим мистическим сокровищем.
Comet Catcher: Шелковистая флуоресцентная фусия с персиковым шпоном. Окуните свои чувства космическим порывом ягодной звездной пыли.
Star Surfer: Гладкое розовое шампанское с серебряным оттенком. Оседлайте волну сливочного звездного света каждый раз, когда окунетесь в это небесное мерцание.
Ray Rider: Бархатистое золотистое шампанское с оттенком персика.Путешествуйте по позолоченным галактикам и высекайте солнечные вспышки на этом блестящем золотом луче.
Sky Walker: Ярко-голубой с ультрафиолетовым оттенком. Усовершенствуйте свою игру с маркером и дотянитесь до неба с этим звездным синим сиянием.
Solar Sailor: Гладкое и сияющее атласное золото. Отбросьте и плывите по морю звезд с этим плавным плавным мерцанием.
Mars Melter: Персиковая карамель, залитая пурпурно-красным свечением.Растопите этот марсианский мусс и побалуйте себя теплой ложкой кремово-малинового и персикового цветов.
Moon Cruiser: Насыщенная неоновая сирень с прохладным, залитым лунным светом, кобальтовым оттенком. Совершите прогулку по невидимым лунным пейзажам на этом сине-фиолетовом хотроде.
Diamond Dasher: Конфеты из кобальта, золота и фуксии переливаются бриллиантами. Рассыпьте звезды и смешайте млечный путь с легким прикосновением к измельченному кристальному сиянию.
Кисть Precision Highlighter Brush
Кисть для хайлайтера с длинной мягкой щетиной и слегка закругленной квадратной головкой. Эта кисть предназначена для того, чтобы быть достаточно острой для точного нанесения, но достаточно широкой, чтобы добиться идеального нанесения хайлайтера всего несколькими мазками. Эта кисть с пушистой щетиной, достаточно гибкой, чтобы плавно растушевывать и размывать хайлайтер, является идеальным инструментом для достижения высокого покрытия и естественных бликов.
Футляр для маркера космической эры
Индивидуальный футляр для всех 9 хайлайтеров космической эры.Внутри есть специальные отсеки для каждого маркера и открывающаяся по длине крышка для легкого доступа.
Размеры: 32,5 x 10 x 10 см
Состав маркера:
Улавливатель комет: Кальций-алюминийборосиликат, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, синтетический воск, нитрид бора, оксид олова, феноксиэтанол, диметикон водорода, гидратированный диоксид кремния, дециленгликоль1, триэтоксикаприлилсилан, диоксид железа (CI 77499, CI 77492).
Star Surfer: Синтетический флюорфлогопит, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, боросиликат кальция и алюминия, боросиликат кальция, натрия, кремнезем, синтетический воск, нитрид бора, феноксиэтанол, диметикон водорода, гидратированный диоксид кремния, триколеноксид олова Диоксид титана (CI 77891), Red 40 Lake (CI 16035), оксиды железа (CI 77499, CI 77492).
Ray Rider: Слюда, синтетический фторфлогопит, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, боросиликат кальция и натрия, парафин, диоксид кремния, нитрид бора, феноксиэтанол, диметикон водорода, оксид олова, гидратированный диоксид кремния, диметилоксилендиоксид кремния, дерицилэтиленгликоль, дерицилэтиленгликольгидратированный кремнезем (CI 77891), оксиды железа (CI 77491, CI 77492).
Sky Walker: Кальций-алюминиевый боросиликат, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, синтетический воск, нитрид бора, диметикон водорода, феноксиэтанол, оксид олова, гидратированный диоксид кремния, дециленгликоль, ПТФЭ, триэтоксикаприлилсилоксид.
Solar Sailor: Кальций-алюминиевый боросиликат, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, синтетический воск, нитрид бора, оксид олова, феноксиэтанол, диметикон водорода, гидратированный диоксид кремния, дециленгликоль, триэтаноксикаприлы, диоксид титана 89, диоксид титана
Mars Melter: кальций-алюминиевый боросиликат, октилдодеканол, этилгексилпальмитат, тальк, парафин, нитрид бора, каприлилгликоль, диметикон водорода, оксид олова, этилгексилглицерин, триэтоксикаприлилсилан, CI-диоксид 77, титан Озеро Желтое 5 (CI 19140).
Moon Cruiser: Кальций-алюминиевый боросиликат, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, синтетический воск, нитрид бора, диметикон водорода, оксид олова, феноксиэтанол, гидратированный диоксид кремния, дециленгликоль, триэтоксикаприлилсилан, диоксид титана 891, диоксид титана 891, диоксид титана.
Diamond Dasher: Кальций-алюминиевый боросиликат, тальк, этилгексилпальмитат, октилдодеканол, синтетический фторфлогопит, диоксид кремния, парафин, нитрид бора, феноксиэтанол, диметикон водорода, оксид олова, гидратированный диоксид кремния, дециленгликоль, дициленгликоль (дициленгликоль) 89 Оксиды железа (CI 77491, CI 77492, CI 77499).
Пророчество космической эры:
Состав: диоксид кремния, диметикон, нитрид бора, тальк, октилдодеканол, этилгексилпальмитат, диметиконол, каприлилгликоль, полибутен, этилгексилглицерин, диметикон водорода, триэтоксикаприлилсилан, диметикон титана
.