Мембранный бак вестер инструкция: Инструкции на Мембранные расширительные баки Wester Premium серии WAV, WAO бренда Wester

{{if StockMainEnable}} на складе {{/if}}

Системы перекачки мокрых резервуаров | Thermo Fisher Scientific

Влажный перенос является наиболее распространенной и традиционной стратегией вестерн-блоттинга благодаря своей эффективности и производительности. Мы предлагаем три системы перекачки баков, которые сводят к минимуму требуемый объем буфера перекачки.

Мембраны для переноса Буферы для переноса

• Системы для влажного переноса
  
• Модуль Mini Blot
  
• Модуль XCell II Blot
  
• SureLock Tandem
  Midi B Лот Модуль
• Заказ
  информация
• Документы

Какая система перекачки с мокрым баком подходит именно вам?

	Модуль мини-блоттинга	XCell II Blot Module	SureLock Tandem Midi Blot Module
Емкость	1 мини-гель на модуль блота; 1–2 модуля блоттинга на бак	1–2 мини-геля на модуль блота; 1 модуль блоттинга на бак	1 миди-гель на модуль блота, 1-2 модуля блота на резервуар
Требования к буферу для переноса	220 мл на блот	800 мл	300 мл на блот
Время переноса	60 мин	60-120 мин	30 мин
Область блоттинга	9 x 9 см	9 x 9 см	9,2 x 14,4 см
Совместимый блок питания	Источники питания PowerEase Touch, системы Owl, для других систем, использующих адаптеры питания Novex (кат. № ZA10001)	Источники питания PowerEase Touch, системы Owl, для других систем, использующих адаптеры питания Novex (кат. № ZA10001)	Блоки питания PowerEase Touch или системы Owl
Необходимое оборудование	Mini Gel Tank	XCell SureLock Mini-Cell или XCell II Mini-Cell 90 031	Тандемный миди-бак с гелем SureLock: вместимость до 2 блоттинга

Удобный, надежный западный трансфер

Два мини-модуля для блоттинга помещаются в мини-бак с гелем и предназначены для простого и удобного переноса вестернов.

• Универсальная модульная конструкция — позволяет устанавливать модули в любую камеру резервуара, упрощая настройку переноса
• Уникальная прокладка — помогает предотвратить утечку буфера, поэтому во время настройки западного переноса не возникает беспорядка
• 1/2-дюймовая буферная камера — требуется вдвое меньше стандартного объема буферов для переноса на основе метанола
• Стандартный 60-минутный протокол переноса — ускоряет ваш западный рабочий процесс, чтобы вы могли быстрее получать результаты
• Прочные электроды, прочные стальные пластины — для высокоэффективных и надежных западных переводов

Пример условий перевода

* Текущее значение s представляют значения при работе с одним гелем и могут варьироваться в зависимости от используемого источника питания.

Видео с инструкциями

Как выполнить вестерн-блот-перенос с использованием модуля Mini Blot Invitrogen

Узнайте, как выполнить вестерн-блот-перенос с помощью модуля Mini Blot в Mini Gel Tank.

Как разделить белки с помощью сборного геля SDS-PAGE Invitrogen

Узнайте, как разделить белки с помощью сборного геля Invitrogen Bolt Bis-Tris Plus SDS-PAGE и мини-гелевого резервуара.

Начните работу с приветственными пакетами модуля Mini Bolt

Блот-модуль XCell II позволяет легко переносить белки или нуклеиновые кислоты из мини-гелей в мембраны. Он идеально вписывается в мини-ячейки XCell SureLock и XCell II вместо узла сердцевины из геля/буфера. Для западного, южного и северного переноса требуется менее 200 мл буфера переноса. Прочные платинированные электроды из титана и нержавеющей стали создают однородное электрическое поле без зажимов или шарнирных держателей геля. Максимальный размер пятна составляет 9 см x 9 см.

Пример условий перевода

Тип геля	Мембрана	Буфер для переноса	Условия переноса	Ожидаемый ток	Время работы
Трис-глицин	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	Трис-глицин Буфер для переноса с 20% метанола. 1X Transfer Buffer должен иметь pH 8,3 перед добавлением SDS или метанола.	25 В постоянное	100 мА	1-2 часа
Tricine	Нитроцеллюлоза или PVDF	Tris-Glycine Transfer Buffer с 20% метанола. 1X Transfer Buffer должен иметь pH 8,3 перед добавлением SDS или метанола.	25 В пост. Буфер для переноса s-Tris с 10 % метанола и антиоксидантом для уменьшенных образцов	30 В, константа	Начало: 170 мА Конец: 100 мА	1 час
Трис-ацетат	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	Бис-трис буфер для переноса с 10 % метанола и антиоксидантом для уменьшенных образцов	30 В, постоянный	60
IEF	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	0,7 % уксусная кислота, pH 3,0	10 В пост. 0031
Замедление TBE, TBE-мочевины и DAN	Нейлон	45 мМ Трис, 45 мМ борная кислота, 1 мМ ЭДТА	30 В постоянное	Начало: 360 мА Конец: 270 мА	1-2 часа

Ожидаемый ток указан в таблице ниже для передачи одного геля. Если вы переносите два геля в модуль блоттинга, ожидаемый ток удвоится.

Для ночного блоттинга перенос при постоянном напряжении 10–15 В.

Узнайте, как использовать модуль блоттинга XCell II

Узнайте, как выполнить перенос мокрого резервуара с помощью модуля блоттинга XCell II в баке SureLock с помощью этого подробное пошаговое видео.

Узнайте, как запустить гель с помощью системы XCell SureLock

Посмотрите это пошаговое видео о том, как запустить сборный элемент NuPAGE в резервуаре SureLock.

Удобный и надежный влажный перенос миди-гелей

Если ваш рабочий процесс вестерн-блоттинга требует более высокой пропускной способности, миди-гели Invitrogen позволяют загружать до 26 образцов на гель. Вы можете использовать резервуар для геля SureLock Tandem Midi Gel Tank для запуска до 2 высокоэффективных гелей Midi Invitrogen и переноса их на мембраны в одном резервуаре с помощью модуля SureLock Tandem Midi Blot. Два тандемных миди-блот-модуля SureLock помещаются в инновационный двойной резервуар для геля SureLock Tandem Midi и предназначены для простого переноса геля при комнатной температуре. Для переноса геля требуется всего 300 мл буфера, содержащего метанол, что снижает затраты на буфер и опасную утилизацию.

• Тандемный миди-гелевый резервуар SureLock 2-в-1 — нет необходимости приобретать отдельный резервуар для переноса в западном направлении
• Перенос при комнатной температуре — экономия времени, планирования и беспорядка, необходимых для предварительного охлаждения с другими системами буферы, замораживание пакетов со льдом или приготовление ледяных бань
• 300 мл на объем буфера для переноса геля — меньший требуемый объем буфера для переноса снижает потребление реагентов и затраты на опасную утилизацию
• Быстро и эффективно — 30-минутный перенос без ущерба для производительности
• Простота в использовании — удобные инструкции по сборке блотов напечатаны на дополнительном лотке для переноса
• Прочные электродные пластины — для высокоэффективного и надежного вестерн-переноса

  9000 3

Начните работу с приветственным пакетом модуля Midi Blot

Стабильные и надежные результаты вестерн-блоттинга

При использовании с высокопроизводительными сборными миди-гелями Invitrogen вы можете положиться на тандемный миди-гелевый резервуар SureLock и модуль миди-блоттинга для получения последовательных высокопроизводительных вестерн-блоттингов. Миди-гели Invitrogen обеспечивают воспроизводимое высокоэффективное разделение белков, что приводит к получению четких полос с хорошим разрешением на прямых дорожках, а модуль тандемного миди-блоттинга SureLock обеспечивает надежный однородный перенос белков через гель.

Чтобы продемонстрировать однородность переноса через мембрану модуля тандемного миди-блоттинга SureLock, гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi был загружен повторяющимися разведениями лизата E. coli в диапазоне 2-0,25 мкг и SeeBlue Plus2 Pre -окрашенный белковый стандарт. Проводили электрофорез и гель переносили на 0,45 мкм PVDF-мембрану. Результаты показаны на Рисунок 1 .

A

Рис. 1. Равномерный перенос с использованием бака с гелем SureLock Tandem Midi Gel Tank.  Нормализация общего белка переносимых белков показывает равномерный перенос по блоту.

A. ПВДФ-блот, помеченный реагентом без окрашивания. В гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi наносили повторяющиеся разведения лизата E. coli в диапазоне от 2 до 0,25 мкг и предварительно окрашенный белковый стандарт SeeBlue Plus2 на дорожках 1-2 и 19-20. Гель подвергли электрофорезу с использованием подвижного буфера MES в резервуаре для геля SureLock Tandem Midi. Белки из геля переносили на мембраны 0,45 мкм PVDF при постоянном напряжении 25 В в течение 30 минут с использованием модуля тандемного миди-блоттинга SureLock. После переноса белки на мембране были помечены в соответствии с протоколом реагента для мечения белков без окрашивания для мембран среднего размера. Изображение было получено с использованием iBright Imager с эпи-настройкой No-Stain Membrane (возбуждение 455-485 нм и эмиссия 565-615 нм). Поскольку предварительно окрашенный белковый стандарт SeeBlue Plus2 уже помечен, не все его белковые полосы можно пометить реагентом без окрашивания, и поэтому не все они видны на этом изображении.

B. Линейность денситометрического сигнала в зависимости от белковой нагрузки. Интенсивность денситометрического сигнала определялась для каждой дорожки. Технические повторы (n=4) были усреднены и построены для определения линейной регрессии для всего диапазона концентраций (R2=0,9994). Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Рекомендуемые условия передачи

Рекомендуемые условия переноса для всех сборных миди-гелей Invitrogen:

Системы мокрого переноса

Какая система перекачки с мокрым баком подходит именно вам?

	Модуль мини-блоттинга	Блот-модуль XCell II	Тандемный миди-блот-модуль SureLock
Емкость	1 мини-гель на модуль блота; 1–2 модуля блоттинга на бак	1–2 мини-геля на модуль блота; 1 модуль блота на бак	1 миди-гель на модуль блота, 1-2 модуля блота на бак
Требования к буферу для переноса	220 мл на блот	800 мл 900 31	300 мл на блот
Время передачи	60 мин	60-120 мин	30 мин
Область для блоттинга	9 x 9 см	9 x 9 см	9,2 x 14,4 см
Совместимый блок питания	Блоки питания PowerEase Touch, системы Owl, для других систем, использующих Адаптеры блоков питания Novex (кат. № ZA10001)	Блоки питания PowerEase Touch, системы Owl, для других систем, использующих адаптеры блоков питания Novex (кат. № ZA10001)	Блоки питания PowerEase Touch или системы Owl
Необходимое оборудование	Mini Gel Tank	XCell SureLock Mini-Cell или XCell II Mini-Cell	SureLock Tandem Midi Gel Tank: вместимость до 2 модулей блоттинга

Модуль Mini Blot

Удобный, надежный западный трансфер

Два мини-модуля для блоттинга помещаются в мини-бак с гелем и предназначены для простого и удобного переноса вестернов.

• Универсальная модульная конструкция — позволяет устанавливать модули в любую камеру резервуара, упрощая настройку переноса
• Уникальная прокладка — помогает предотвратить утечку буфера, поэтому при настройке западного переноса не возникнет беспорядка
• 1/2-дюймовая буферная камера — требуется половина стандартного объема буферов для переноса на основе метанола
• Стандартный 60-минутный протокол переноса — ускоряет ваш западный рабочий процесс, чтобы вы могли быстрее получать результаты
• Прочные электроды, прочные стальные пластины — для высокоэффективных и надежных западных переводов

Пример условий перевода

* Текущие показания представляют значения при работе с одним гелем и могут варьироваться в зависимости от источника питания. быть использованным.

Видео с инструкциями

Как выполнить вестерн-блот-перенос с использованием модуля Mini Blot Invitrogen

Узнайте, как выполнить вестерн-блот-перенос с помощью модуля Mini Blot в Mini Gel Tank.

Как разделить белки с помощью сборного геля SDS-PAGE Invitrogen

Узнайте, как разделить белки с помощью сборного геля Invitrogen Bolt Bis-Tris Plus SDS-PAGE и мини-гелевого резервуара.

Начните работу с приветственными пакетами модуля Mini Bolt

Модуль XCell II Blot

Блот-модуль XCell II позволяет легко переносить белки или нуклеиновые кислоты из мини-гелей в мембраны. Он идеально подходит для XCell SureLock 9.0325 и мини-ячейки XCell II вместо узла ядра геля/буфера. Для западного, южного и северного переноса требуется менее 200 мл буфера переноса. Прочные платинированные электроды из титана и нержавеющей стали создают однородное электрическое поле без зажимов или шарнирных держателей геля. Максимальный размер пятна составляет 9 см x 9 см.

Пример условий перевода

Тип геля	Мембрана	Буфер для переноса	Условия переноса	Ожидаемый ток	Время работы
Трис-глицин	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	Трис-глицин Буфер для переноса с 20% метанола. 1X Transfer Buffer должен иметь pH 8,3 перед добавлением SDS или метанола.	25 В постоянное	100 мА	1-2 часа
Трицин	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	Трис-Гли Cine Transfer Buffer с 20% метанола. 1X Transfer Buffer должен иметь pH 8,3 перед добавлением SDS или метанола.	25 В постоянное	Пуск: 100 мА	1-2 часа
Бис-Трис	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	Бис – Трис-буфер для переноса с 10 % метанола и антиоксидантом для уменьшенных образцов	30 В, константа	Начало: 170 мА Конец: 100 мА	1 час
Трис-ацетат	Нитроцеллюлоза или ПВДФ образцы	30 В пост.	Начало: 200 мА Конец: 180 мА	60
IEF	Нитроцеллюлоза или ПВДФ	0,7% уксусная кислота, pH 3.0	10 В постоянное	Пуск: 65-85 мА	60
Замедление TBE, TBE-мочевины и DAN	Нейлон	45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 1 мМ ЭДТА	30 В, постоянный	1-2 час

Ожидаемый ток, указанный в таблице ниже, рассчитан на передачу одного геля. Если вы переносите два геля в модуль блоттинга, ожидаемый ток удвоится.

Для ночного блоттинга перенос при постоянном напряжении 10–15 В.

Узнайте, как использовать модуль блоттинга XCell II

Узнайте, как выполнить перенос мокрого резервуара с помощью модуля блоттинга XCell II в резервуаре SureLock с помощью этого подробное пошаговое видео.

Узнайте, как запустить гель с помощью системы XCell SureLock

Посмотрите это пошаговое видео о том, как запустить сборный элемент NuPAGE в резервуаре SureLock.

Модуль миди-блоттинга SureLock Tandem

Удобный и надежный влажный перенос миди-гелей

Если ваш рабочий процесс вестерн-блоттинга требует более высокой пропускной способности, миди-гели Invitrogen позволяют загружать до 26 образцов на гель. Вы можете использовать резервуар для геля SureLock Tandem Midi Gel Tank для запуска до 2 высокоэффективных гелей Midi Invitrogen и переноса их на мембраны в одном резервуаре с помощью модуля SureLock Tandem Midi Blot. Два тандемных миди-блот-модуля SureLock помещаются в инновационный двойной резервуар для геля SureLock Tandem Midi и предназначены для простого переноса геля при комнатной температуре. Для переноса геля требуется всего 300 мл буфера, содержащего метанол, что снижает затраты на буфер и опасную утилизацию.

• Тандемный миди-гелевый резервуар SureLock 2-в-1 — нет необходимости приобретать отдельный резервуар для переноса в западном направлении
• Перенос при комнатной температуре — экономия времени, планирования и беспорядка, необходимых для предварительного охлаждения с другими системами буферы, замораживание пакетов со льдом или приготовление ледяных бань
• 300 мл на объем буфера для переноса геля — меньший требуемый объем буфера для переноса снижает потребление реагентов и затраты на опасную утилизацию
• Быстро и эффективно — 30-минутный перенос без ущерба для производительности
• Простота в использовании — удобные инструкции по сборке блотов напечатаны на дополнительном лотке для переноса
• Прочные электродные пластины — для высокоэффективного и надежного вестерн-переноса

  9000 3

Начните работу с приветственным пакетом модуля Midi Blot

Стабильные и надежные результаты вестерн-блоттинга

При использовании с высокопроизводительными сборными миди-гелями Invitrogen вы можете положиться на тандемный миди-гелевый резервуар SureLock и модуль миди-блоттинга для получения последовательных высокопроизводительных вестерн-блоттингов. Миди-гели Invitrogen обеспечивают воспроизводимое высокоэффективное разделение белков, что приводит к получению четких полос с хорошим разрешением на прямых дорожках, а модуль тандемного миди-блоттинга SureLock обеспечивает надежный однородный перенос белков через гель.

Чтобы продемонстрировать однородность переноса через мембрану модуля тандемного миди-блоттинга SureLock, гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi был загружен повторяющимися разведениями лизата E. coli в диапазоне 2-0,25 мкг и SeeBlue Plus2 Pre -окрашенный белковый стандарт. Проводили электрофорез и гель переносили на 0,45 мкм PVDF-мембрану. Результаты показаны на Рисунок 1 .

A

B

Рис. 1. Равномерный перенос с использованием бака с гелем SureLock Tandem Midi Gel Tank.  Нормализация общего белка переносимых белков показывает равномерный перенос по блоту.

A. ПВДФ-блот, помеченный реагентом без окрашивания. В гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi наносили повторяющиеся разведения лизата E. coli в диапазоне от 2 до 0,25 мкг и предварительно окрашенный белковый стандарт SeeBlue Plus2 на дорожках 1-2 и 19-20. Гель подвергли электрофорезу с использованием подвижного буфера MES в резервуаре для геля SureLock Tandem Midi. Белки из геля переносили на мембраны 0,45 мкм PVDF при постоянном напряжении 25 В в течение 30 минут с использованием модуля тандемного миди-блоттинга SureLock. После переноса белки на мембране были помечены в соответствии с протоколом реагента для мечения белков без окрашивания для мембран среднего размера. Изображение было получено с использованием iBright Imager с эпи-настройкой No-Stain Membrane (возбуждение 455-485 нм и эмиссия 565-615 нм). Поскольку предварительно окрашенный белковый стандарт SeeBlue Plus2 уже помечен, не все его белковые полосы можно пометить реагентом без окрашивания, и поэтому не все они видны на этом изображении.

B. Линейность денситометрического сигнала в зависимости от белковой нагрузки. Интенсивность денситометрического сигнала определялась для каждой дорожки. Технические повторы (n=4) были усреднены и построены для определения линейной регрессии для всего диапазона концентраций (R2=0,9994). Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

Рекомендуемые условия передачи

Рекомендуемые условия переноса для всех сборных миди-гелей Invitrogen:

Постоянное напряжение (В)	Время (мин)
25	30

Информация для заказа

Документы

Ресурсы

Загрузить: Техническое руководство по электрофорезу в белковом геле

Доступ: Протоколы, советы и рекомендации, а также устранение неполадок при электрофорезе

Только для исследовательских целей. Не для использования в диагностических процедурах.

Дополнение: вестерн-блоттинг

---

Введение

Вестерн-блоттинг — это метод, используемый для разделения белков по размеру с последующим обнаружением с использованием антител, специфичных к интересующему белку. В этом протоколе описываются основные этапы лизиса клеток, определения общей концентрации белка в лизате, запуска готового геля SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Совместное использование ускоряет науку. Мы считаем, что предоставление полной информации о наших протоколах поддерживает воспроизводимость и ускоряет науку. Здесь мы перечисляем конкретное оборудование, реагенты и методы, которые мы используем в нашей лаборатории в Addgene. Оборудование и реагенты других поставщиков должны давать аналогичные результаты при использовании этих протоколов. Однако имейте в виду, что может потребоваться корректировка протокола для учета небольших различий между продуктами. Addgene не поддерживает и не рекомендует конкретные продукты или оборудование. Включение этой информации исключительно для прозрачности, предназначенной для поддержки воспроизводимости в науке.

Общие указания

• Процентное содержание акриламида варьируется в гелях SDS-PAGE. Используйте более низкое процентное содержание акриламида при иммуноблотинге белков с высокой молекулярной массой и более высокое процентное содержание акриламида при иммуноблотинге белков с низкой молекулярной массой.

• В этом протоколе используется устройство для сухого переноса, но его можно адаптировать для влажного и полусухого способов переноса.

Последнее обновление: 24 января 2022 г.

Хронология рабочего процесса

• День 1: Подготовка лизатов, проведение SDS-PAGE, перенос, блокирование, инкубация с первичными антителами
• День 2: Инкубация со вторичным антителом

Видео

Посмотрите это обучающее видео, чтобы узнать, как использовать вестерн-блоттинг для визуализации белка из клеток или образцов тканей.

Оборудование

• Микроцентрифуга
• Одноканальная пипетка 0,5–10 мкл
• Одноканальная пипетка 2–20 мкл
• Одноканальная пипетка 20–200 мкл
• Одноканальная пипетка 200–1000 мкл
• Контроллер пипетки
• Наконечники для пипеток и пипетки
• Спектрофотометр
• Тепловой блок
• Камера мини-гелевого резервуара
• Блок питания
• Устройство для переноса геля iBlot 2
• Ролик
• Шпатель
• Платформенный шейкер
• Холодильная камера
• Гелевый имидж-сканер
• Морозильная камера -80 °C

Реагенты

• 1X ПБС
• Буфер для лизиса, например, буфер для лизиса RIPA
• Микроцентрифужные пробирки
• Анализ BCA, Thermo Fisher 23227
• β-меркаптоэтанол
• 4-кратный буфер для загрузки белка
• Сборный гель SDS-PAGE
• Рабочий буфер SDS-PAGE
• Предварительно окрашенная белковая лестница
• Этанол
• iBlot 2 PVDF Mini Stack, Thermo Fisher IB24002
• 20X ТБС
• Твин-20
• Молоко сухое обезжиренное
• 96-луночный планшет для микротитрования
• Хемилюминесцентная подложка
• Полиэтиленовая пленка
• Первичное антитело
• Вторичное антитело
• Деионизированная вода

Перед запуском

Обратитесь к инструкциям производителя для получения дополнительной информации, относящейся к вашему антителу, такой как идеальный блокирующий буфер и оптимальные концентрации антител. Рассмотрите возможность титрования антител, чтобы определить оптимальную дозу.

Вторичные антитела должны соответствовать виду хозяина первичного антитела. Например, используйте вторичные антимышиные антитела для первичных антител, выработанных у мыши.

Процедура

Раздел 1: клетки лизиса

1. Центрифуга 5 x 10 ⁶ клетки для 5 мин при 100 x г .
2. Аккуратно удалите супернатант.
3. Ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл 1X PBS и перенесите в микроцентрифужную пробирку.
4. Центрифуга для 5 мин при 100 x г .
5. Осторожно удалите супернатант.
6. Ресуспендируйте клеточный осадок в соответствующем объеме буфера для холодного лизиса.

   *Pro-Tip* Объем лизирующего буфера зависит от размера клеточного осадка, но обычно составляет от 250–1000 мкл .

   *Pro-Tip* Идеальный буфер для лизиса зависит от локализации интересующего белка в клетке. Буфер RIPA подходит для большинства белков, но для трудно экстрагируемых белков, таких как белки в ядре, могут потребоваться более строгие буферы и стадия обработки ультразвуком.

7. Инкубировать на льду в течение 30 мин .
8. Лизат отцентрифугировать на 15 мин при 14 000 x г при 4 °C .
9. Перенесите супернатант в чистую микроцентрифужную пробирку.
10. Лизат следует использовать немедленно или хранить при температуре -80 °C до готовности к использованию.

Раздел 2. Определение концентрации общего белка и подготовка лизата для SDS-PAGE

11. Определите концентрацию белка, используя набор для анализа BCA компании Pierce или другой предпочтительный метод определения белка.
1. Приготовьте 50:1 разведение реагента А к реагенту В для анализа ВСА.
2. Приготовьте серийные разведения стандарта BSA в диапазоне 0–2000 мкг/мл .
3. В двух повторностях разбавьте 10 мкл стандартных, пустых образцов и образцов лизата в 200 мкл реагента BCA в 96-луночном микротитрационном планшете.
4. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C .
5. Определить поглощение при 590 нм .
6. Рассчитайте среднее поглощение дубликатов образцов на пластине.
7. Вычтите среднее поглощение бланка из всех образцов.
8. Постройте стандартную кривую стандартной концентрации БСА в зависимости от абсорбции.
9. Экстраполируйте общую концентрацию белка в образце из стандартной кривой.
12. Определите объем образца, необходимый для загрузки эквивалентного количества общего белка для каждого образца.

    *Pro-Tip* Идеальная общая загруженность белком зависит от образца и целевого белка, но обычно составляет 10–50 мкг . Если содержание белка в образце низкое, вам потребуется загрузить большее количество общего белка.

13. Подготовьте образец к загрузке следующим образом:
1. Добавьте 10% об./об. β-меркаптоэтанола к буферу для загрузки белка 4X.
2. Разбавьте 4X буфер загрузки белка в образце до 1X .
14. Прокипятить образцы для 10 мин при 100 °C .

Раздел 3: SDS-СТРАНИЦА

15. Приготовьте сборный гель следующим образом:
1. Достаньте гель из пластиковой упаковки.
2. Снимите ленту и пластиковую расческу.
3. Промойте лунки деионизированной водой 3x .
4. Аккуратно встряхивайте гель между мытьями, чтобы удалить остатки воды.
5. Загрузите гель в камеру резервуара с гелем SDS-PAGE.

*Pro-Tip* Различные емкости с гелем SDS-PAGE будут иметь различную ориентацию геля. См. инструкции для вашего конкретного резервуара.

6. Закройте зажим.
16. Подготовьте рабочий буфер 1X следующим образом:

• Разбавьте 25 мл рабочего буфера 20X до 500 мл деионизированной водой. Хорошо перемешать.

Заполните камеру гель-бака SDS-PAGE рабочим буфером 1X.

Загрузите образцы в гель.

Загрузите 5–10 мкл предварительно окрашенной белковой лестницы.

Поместите крышку на резервуар и подключите шнуры электродов к источнику питания.

Запускайте гель при 100 В на 10–15 мин или до тех пор, пока образцы не переместятся из лунок в гель.

Увеличьте напряжение до 150 В и продолжайте работать с гелем, пока не получите желаемое разделение.

Аккуратно откройте гель шпателем.

Раздел 4: Сухой перенос

24. Замачивание геля для 15 мин в 20% этаноле в деионизированной воде.

• Чтобы приготовить 20% этанол, разбавьте 2 мл этанола в 8 мл деионизированной воды и хорошо перемешайте.

Соберите трансферный сэндвич следующим образом:

1. Распечатайте стопку переноса iBlot 2 PVDF Mini.
2. Отложите верхнюю стопку в сторону и выбросьте белый разделитель.
3. Держите нижний стек в пластиковом лотке.
4. Поместите нижний стек на промокательную поверхность.
5. Совместите электрические контакты на промокательной поверхности устройства для переноса геля iBlot 2.
6. Смочите гель перед запуском в деионизированной воде и поместите его на передающую мембрану нижнего стека.
7. Замочите кусок фильтровальной бумаги iBlot в деионизированной воде.
8. Поместите предварительно смоченную фильтровальную бумагу iBlot на гель и удалите пузырьки воздуха валиком.
9. Поместите Top Stack на предварительно смоченную фильтровальную бумагу.
10. Удалите пузырьки воздуха с помощью валика.
11. Поместите впитывающую прокладку поверх верхней стопки так, чтобы электрические контакты совпадали с соответствующими электрическими контактами на промокательной поверхности устройства для переноса геля iBlot 2.
12. Закройте крышку устройства.
13. Выберите нужный метод и убедитесь, что параметры указаны верно.

• Перенос для 5–6 мин для белков <30 кДа.
• Перенос для 8–10 мин для белков >150 кДа.

Выберите «Начать прогон».

По завершении выполнения выберите Готово.

Раздел 5: Блокировка

27. Приготовьте 1X TBST следующим образом:

• 25 мл 20X TBS
• 2,5 мл твин-20
• 472,5 мл деионизированной воды
• Хорошо перемешать

Подготовьте блокирующий буфер следующим образом:

• Разбавьте 5% вес/объем обезжиренного молока в 1X TBST.
• Пример: 5 г обезжиренного молока в 100 мл 1X TBST.

*Pro-Tip* Идеальный блокирующий буфер зависит от антител. Перед проведением эксперимента ознакомьтесь с информацией производителя.

Снимите мембрану с устройства для переноса и поместите ее в контейнер с 1X TBST белковой стороной вверх.

Заблокируйте мембрану в блокирующем буфере на 1 ч при RT на платформе для встряхивания.

Промойте мембрану 3x для 5 мин в 1X TBST при RT на платформе для встряхивания.

Раздел 6: Инкубация антител

32. Разбавьте первичное антитело до желаемой концентрации в блокирующем буфере.

    *Pro-Tip* Оптимальная концентрация зависит от антител, но обычно составляет 1–10 мкг/мл.

33. Инкубируйте мембрану в течение ночи в первичных антителах при 90 568 4 °C 90 570 на качающейся платформе.

    *Pro-Tip* Время инкубации с первичными антителами можно сократить до 2 ч at RT , но может привести к более неспецифическому связыванию.

34. Промойте мембрану 3x для 5 мин в 1X TBST при RT на платформе для встряхивания.
35. Разбавьте вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, до нужной концентрации в блокирующем буфере.

    *Pro-Tip* Оптимальная концентрация зависит от антител, но обычно составляет 1–10 мкг/мл.

36. Инкубируйте мембрану со вторичным антителом в течение 60 мин при RT на платформе для встряхивания.
37. Промойте мембрану 3x для 5 мин в 1X TBST при RT на платформе для встряхивания.
38. Подготовьте субстрат для хемилюминесценции, смешав реагент A 1:1 с реагентом B.
39. Аккуратно инкубируйте мембрану в хемилюминесцентном реагенте в течение 90 568 5 мин 90 570 при 90 568 RT 90 570 .
40. Накройте мембрану прозрачным пластиком и используйте гелевый имидж-сканер с обнаружением хемилюминесценции или темную комнату для обнаружения полос.

Советы и способы устранения неполадок

• Оптимальный буфер для лизиса зависит от типа образца и локализации интересующего белка в клетке. Возможно, вам придется попробовать различные буферы для лизиса, чтобы найти лучший для вашей цели.