Полная версия snailv2: Улитка теплый пол полная версия

Music | paipostflowal

$root.artistsMenu.setActiveLabelMemberBand(id)”>••• $root.artistsMenu.setActiveLabelMemberBand(id)”>show less

1. Dsm 5 francais pdf torrent
   Main page

2. Афанасьев людочка читать онлайн
   Main page

3. Гдз 3 клас природознавство зошит рина жаркова лариса мечник 2016
   Main page

4. Драйвер для принтера hp laserjet 3052 скачать
   Main page

5. Snail v2 ключ
   Main page

6. Download corel products keygen core x7
   Main page

7. Оятал курси сураси узбекча
   Main page

8. Гдз по алгебре 10 класс алимов колягин ткачева федорова
   Main page

9. Bf video setup exe youtube video
   Main page

10. Autocad 2008 64 bit keygen xforce
    Main page

11. Турецкий метод заучивания корана
    Main page

12. Гдз контурные карты по истории нового времени 7 класс дрофа
    

    Main page

13. Download lagu system of a down toxicity album
    Main page

14. Ezdrummer keygen team air
    Main page

15. Подвиг на полюсе холода стругацкий владимир
    

    Main page

16. Инструкция sony kv m2100k
    Main page

17. Вианна стайбл тета-исцеление скачать epub
    Main page

18. Show windows 7 ultimate product key free download
    

    Main page

19. Скачать scp secret laboratory через торрент
    Main page

20. Bosch esi tronic 2012 1 dvd1 dvd2 dvd3 patch i keygen
    Main page

21. Торговый квартал игра скачать бесплатно
    

    Main page

22. Стерва выходит замуж скачать бесплатно
    Main page

23. Алета 2 книга читать онлайн продолжение
    Main page

24. Укус клеща код мкб 10
    Main page

25. Светлана ройз книги скачать бесплатно
    Main page

26. Айгул шаршен кызы ойнош
    Main page

27. Email extractor pro registration key
    Main page

28. Гдз по литературе 10 класс сахаров зинин 1 часть ответы
    Main page

29. Apcfix полная версия скачать бесплатно
    Main page

30. Унч схемы на транзисторах
    Main page

31. Индийский фильм богбон узбек тилида
    Main page

32. Crack shot plus leak
    Main page

33. Beachbody body beast workout torrent
    Main page

34. Ответы тестов tqdk 7 класс математика
    Main page

35. Князь ахкубеков 1919
    Main page

36. Скачать фильм спаун 2 через торрент в хорошем качестве
    Main page

37. Гдз з хімії 7 клас л. с.дячук м.м.гладюк
    Main page

38. Моды из сборки дюжина приключений
    Main page

39. Бетакортен Крем Инструкция
    Main page

40. Скачать mathcad 14 rus crack бесплатно
    Main page

contact / help

Contact paipostflowal

Streaming and
Download help

Report this account

• log in
• terms of use
• privacy
• copyright policy
• switch to mobile view

 

Snail2 является важным медиатором индуцированного Twist1 эпителиально-мезенхимального перехода и метастазирования

1. Fidler IJ. Патогенез метастазирования рака: пересмотр гипотезы «семени и почвы». Нат Рев Рак. 2003; 3: 453–8. [PubMed] [Google Scholar]

2. Thiery JP. Эпителиально-мезенхимальные переходы в опухолевой прогрессии. Нат Рев Рак. 2002; 2: 442–54. [PubMed] [Google Scholar]

3. Ян Дж., Вайнберг Р.А. Эпителиально-мезенхимальный переход: на перекрестке развития и метастазирования опухоли. Ячейка Дев. 2008; 14: 818–29.. [PubMed] [Google Scholar]

4. Hay ED. Обзор эпителиомезенхимальной трансформации. Acta Anat (Базель) 1995; 154:8–20. [PubMed] [Google Scholar]

5. Frixen UH, Behrens J, Sachs M, et al. Опосредованная Е-кадгерином межклеточная адгезия предотвращает инвазивность клеток карциномы человека. Джей Селл Биол. 1991; 113: 173–85. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

6. Perl AK, Wilgenbus P, Dahl U, Semb H, Christofori G. Причинная роль E-кадгерина в переходе от аденомы к карциноме. Природа. 1998;392:190–3. [PubMed] [Google Scholar]

7. Vincent-Salomon A, Thiery JP. Микроокружение хозяина в развитии рака молочной железы: эпителиально-мезенхимальный переход в развитии рака молочной железы. Рак молочной железы Res. 2003; 5: 101–6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

8. Giroldi LA, Bringuier PP, de Weijert M, Jansen C, van Bokhoven A, Schalken JA. Роль E-боксов в репрессии экспрессии E-кадгерина. Biochem Biophys Res Commun. 1997; 241:453–8. [PubMed] [Академия Google]

9. Hennig G, Behrens J, Truss M, Frisch S, Reichmann E, Birchmeier W. Прогрессирование клеток карциномы связано с изменениями в структуре хроматина и связыванием факторов на промоторе E-кадгерина in vivo. Онкоген. 1995; 11: 475–84. [PubMed] [Google Scholar]

10. Batlle E, Sancho E, Franci C, et al. Фактор транскрипции snail является репрессором экспрессии гена Е-кадгерина в эпителиальных опухолевых клетках. Nat Cell Biol. 2000; 2:84–9. [PubMed] [Google Scholar]

11. Cano A, Perez-Moreno MA, Rodrigo I, et al. Фактор транскрипции snail контролирует эпителиально-мезенхимальные переходы путем подавления экспрессии E-кадгерина. Nat Cell Biol. 2000;2:76–83. [PubMed] [Академия Google]

12. Хайра К.М., Чен Д.Ю., Фирон Э.Р. Белок цинковых пальцев SLUG подавляет E-кадгерин при раке молочной железы. Рак рез. 2002; 62:1613–8. [PubMed] [Google Scholar]

13. Eger A, Aigner K, Sonderegger S, et al. DeltaEF1 является репрессором транскрипции E-кадгерина и регулирует пластичность эпителия в клетках рака молочной железы. Онкоген. 2005; 24:2375–85. [PubMed] [Google Scholar]

14. Comijn J, Berx G, Vermassen P, et al. Двуручный Е-бокс, связывающий белок цинковых пальцев SIP1, подавляет Е-кадгерин и индуцирует инвазию. Мол Ячейка. 2001; 7: 1267–78. [PubMed] [Академия Google]

15. Yang J, Mani SA, Donaher JL, et al. Twist, главный регулятор морфогенеза, играет существенную роль в метастазировании опухоли. Клетка. 2004; 117:927–39. [PubMed] [Google Scholar]

16. Ньето М.А. Суперсемейство факторов транскрипции цинковых пальцев улитки. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3: 155–66. [PubMed] [Google Scholar]

17. Van de Putte T, Maruhashi M, Francis A, et al. У мышей, лишенных ZFHX1B, гена, который кодирует Smad-взаимодействующий белок-1, выявлена ​​роль множественных дефектов клеток нервного гребня в этиологии болезни Гиршпрунга и синдрома умственной отсталости. Am J Hum Genet. 2003; 72: 465–70. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

18. Elenbaas B, Spirio L, Koerner F, et al. Клетки рака молочной железы человека, полученные путем онкогенной трансформации первичных эпителиальных клеток молочной железы. Гены Дев. 2001; 15:50–65. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

19. Neve RM, Chin K, Fridlyand J, et al. Коллекция клеточных линий рака молочной железы для изучения функционально различных подтипов рака. Раковая клетка. 2006; 10: 515–27. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

20. Гительман И. Твист-белок в эмбриогенезе мыши. Дев биол. 1997;189:205–14. [PubMed] [Google Scholar]

21. Mittal MK, Myers JN, Misra S, Bailey CK, Chaudhuri G. Связывание in vivo и функциональная репрессия промотора гена VDR с помощью SLUG в клетках молочной железы человека. Biochem Biophys Res Commun. 2008; 372:30–4. [Статья PMC free] [PubMed] [Google Scholar]

22. Kilmartin JV, Wright B, Milstein C. Крысиные моноклональные антитубулиновые антитела, полученные с использованием новой несекретирующей клеточной линии крыс. Джей Селл Биол. 1982; 93: 576–82. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hooghe B, Hulpiau P, van Roy F, De Bleser P. ConTra: инструмент анализа выравнивания промоторов для идентификации сайтов связывания факторов транскрипции у разных видов. Нуклеиновые Кислоты Res. 2008;36:W128–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

24. Bolstad BM, Irizarry RA, Astrand M, Speed ​​TP. Сравнение методов нормализации данных массива олигонуклеотидов высокой плотности на основе дисперсии и систематической ошибки. Биоинформатика. 2003; 19: 185–93. [PubMed] [Google Scholar]

25. Иризарри Р. А., Болстад Б.М., Коллин Ф., Коуп Л.М., Хоббс Б., Спид Т.П. Сводка данных уровня зонда Affymetrix GeneChip. Нуклеиновые Кислоты Res. 2003;31:e15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

26. Littlewood TD, Hancock DC, Danielian PS, Parker MG, Evan GI. Модифицированный лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена как улучшенный переключатель для регуляции гетерологичных белков. Нуклеиновые Кислоты Res. 1995; 23:1686–90. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

27. Лептин М. скручивание и улитка как положительные и отрицательные регуляторы во время развития мезодермы дрозофилы. Гены Дев. 1991; 5: 1568–76. [PubMed] [Google Scholar]

28. Miller LD, Smeds J, George J, et al. Сигнатура экспрессии для статуса p53 при раке молочной железы человека предсказывает статус мутации, транскрипционные эффекты и выживаемость пациентов. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102:13550–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

29. Pawitan Y, Bjohle J, Amler L, et al. Профилирование экспрессии генов избавляет пациентов с ранним раком молочной железы от адъювантной терапии: получено и подтверждено в двух популяционных когортах. Рак молочной железы Res. 2005; 7: R953–64. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

30. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al. Профилирование экспрессии генов при раке молочной железы: понимание молекулярной основы гистологической степени для улучшения прогноза. J Natl Cancer Inst. 2006; 98: 262–72. [PubMed] [Академия Google]

31. Мартин Т.А., Гоял А., Уоткинс Г., Цзян В.Г. Экспрессия факторов транскрипции snail, slug и twist и их клиническое значение при раке молочной железы человека. Энн Сург Онкол. 2005; 12: 488–96. [PubMed] [Google Scholar]

32. Чжан С., Климковски М.В. Неожиданная функциональная избыточность между Twist и Slug (Snail2) и их регуляция NF-kappaB по обратной связи через Nodal и Cerberus. Дев биол. 2009; 331:340–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

33. Rodrigues CO, Nerlick ST, White EL, Cleveland JL, King ML. Регуляторная цепь Myc-Slug (Snail2)/Twist управляет развитием сосудов. Разработка. 2008;135:1903–11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

34. Conacci-Sorrell M, Simcha I, Ben-Yedidia T, Blechman J, Savagner P, Ben-Zeev A. Авторегуляция экспрессии E-кадгерина с помощью кадгерина -кадгериновые взаимодействия: роль передачи сигналов бета-катенина, слизней и МАРК. Джей Селл Биол. 2003; 163: 847–57. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

35. Ондер Т.Т., Гупта Б.П., Мани С.А., Ян Дж., Ландер Э.С., Вайнберг Р.А. Потеря E-кадгерина способствует метастазированию через несколько нижестоящих путей транскрипции. Исследования рака. 2008;68:3645–54. [PubMed] [Академия Google]

36. Gradl D, Kuhl M, Wedlich D. Преобразователь сигналов Wnt/Wg бета-катенин контролирует экспрессию фибронектина. Мол Селл Биол. 1999;19:5576–87. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

37. De Langhe SP, Sala FG, Del Moral PM, et al. Dickkopf-1 (DKK1) показывает, что фибронектин является основной мишенью передачи сигналов Wnt в морфогенезе ветвления легких эмбрионов мышей. Дев биол. 2005; 277:316–31. [PubMed] [Google Scholar]

38. Gilles C, Polette M, Mestdagt M, et al. Трансактивация виментина бета-катенином в клетках рака молочной железы человека. Рак рез. 2003; 63: 2658–64. [PubMed] [Академия Google]

39. Bindels S, Mestdagt M, Vandewalle C, et al. Регуляция виментина с помощью SIP1 в клетках эпителиальной опухоли молочной железы человека. Онкоген. 2006; 25:4975–85. [PubMed] [Google Scholar]

40. Gregory PA, Bert AG, Paterson EL, et al. Семейство миР-200 и миР-205 регулируют переход от эпителия к мезенхиме путем нацеливания на ZEB1 и SIP1. Nat Cell Biol. 2008; 10: 593–601. [PubMed] [Google Scholar]

41. Парк С.М., Гаур А.Б., Ленгьел Э., Питер М.Э. Семейство miR-200 определяет эпителиальный фенотип раковых клеток путем нацеливания на репрессоры E-кадгерина ZEB1 и ZEB2. Гены Дев. 2008;22:894–907. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

42. Bracken CP, Gregory PA, Kolesnikoff N, et al. Петля двойной отрицательной обратной связи между ZEB1-SIP1 и семейством микроРНК-200 регулирует эпителиально-мезенхимальный переход. Рак рез. 2008; 68: 7846–54. [PubMed] [Google Scholar]

43. Korpal M, Lee ES, Hu G, Kang Y. Семейство миР-200 ингибирует эпителиально-мезенхимальный переход и миграцию раковых клеток путем прямого нацеливания на репрессоры транскрипции E-кадгерина ZEB1 и ZEB2. Дж. Биол. Хим. 2008;283:14910–4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

44. Ayyanathan K, Peng H, Hou Z, et al. Белок домена LIM Ajuba является корепрессором для репрессии, опосредованной доменом SNAG, и участвует в ядерно-цитоплазматическом шаттле. Рак рез. 2007; 67: 9097–106. [PubMed] [Google Scholar]

45. Лангер Э.М., Фэн Ю., Чжаоюань Х., Раушер Ф.Дж., 3-й, Кролл К.Л., Лонгмор Г.Д. Белки Ajuba LIM представляют собой корепрессоры улиток/слизняков, необходимые для развития нервного гребня у Xenopus. Ячейка Дев. 2008; 14: 424–36. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Деацетилазы гистонов ингибируют EMT, опосредованную Snail2, во время метастазирования клеток гепатоцеллюлярной карциномы

Введение

, 2018). Резекция и трансплантация для лечения рака печени являются традиционными, но затруднены из-за высокой частоты рецидивов и развития метастазов (Forner et al., 2012). В многочисленных исследованиях сообщалось, что эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) является важным этапом, увеличивающим метастазирование опухолевых клеток в груди (Thiery et al., 2009).), рак предстательной железы (Khan et al., 2015), печени (van Zijl et al., 2009) и легких (Soltermann et al., 2008). Накопленные данные свидетельствуют о том, что ЕМТ является важным этапом инициации метастазирования рака печени (Nieto et al., 2016). Следовательно, для снижения заболеваемости и смертности от рака печени профилактика ЕМТ имеет решающее значение для подавления метастазирования.

Регуляция ЕМТ включает несколько факторов роста (например, трансформирующий фактор роста (TGF), фактор роста гепатоцитов и фактор роста эпидермиса) (Said and Williams, 2011) и ингибиторы транскрипции (например, Snail, ZEB1 и Twist) ( Диас-Лопес и др., 2015). В опухолевых клетках эти факторы роста и ингибиторы транскрипции могут регулировать ЭМП с помощью внеклеточных стимулов, происходящих из микроокружения опухоли. Семейство Snail включает Snail1, Snail2 и Snail3, которые представляют собой группу тесно связанных факторов транскрипции цинковых пальцев. Как факторы транскрипции, они могут регулировать ЕМТ и миграцию клеток. Члены этого семейства, особенно Snail1 и Snail2, функционируют в первую очередь как репрессоры транскрипции генов, регулирующие множество специфичных для эпителия генов, участвующих в клеточной адгезии и идентичности эпителиальных клеток (Kajita et al., 2004). Предыдущее исследование показало, что Snail2 участвует в EMT и метастазировании опухоли. В опухолях молочной железы человека Snail2 и Twist1 способствуют EMT и метастазированию опухоли (Casas et al. , 2011). Аберрантная экспрессия JMJD3 может усиливать экспрессию Snail2, чтобы способствовать раковым свойствам при HCC, таким как поведение, подобное стволовым клеткам, и метастазирование (Tang et al., 2016).

Несколько исследований показали, что эпигенетическая регуляция может регулировать экспрессию генов и активацию сигнальных путей. Ингибиторы HDAC использовались при лечении некоторых видов рака, поскольку гистоновые деацетилазы (HDAC) участвуют в метастатическом процессе рака (Wang et al., 2018). Стабилизация HDAC1 через ось TCL1-pAKT-CHFR является ключевым элементом для опосредованной NANOG мультирезистентности и стволового фенотипа в опухолевых клетках, подвергнутых иммунному редактированию (Woo et al., 2018). Кроме того, HDAC1 способствуют пролиферации и инвазии клеток глиобластомы посредством активации сигнальных путей фосфоинозитид-3-киназы/AKT и митоген-активируемой протеинкиназы/киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (Li et al., 2018). Более того, при раке протоков поджелудочной железы ингибитор HDAC подавляет EMT путем нацеливания на Snail1 (Shinke et al. , 2018).

В этом исследовании мы продемонстрировали, что среди факторов репрессии транскрипции, связанных с EMT, только Snail2 значительно активируется во время EMT, индуцированного TGF-β1, в клетках HL-7702. Напротив, замалчивание Snail2 способствует экспрессии E-cadherin и подавляет экспрессию Vimentin. Кроме того, в клетках HL-7702 сверхэкспрессия Snail2 индуцирует инвазивную миграцию клеток HL-7702 in vitro и в модели на мышах. Примечательно, что HDAC1 и HDAC3 действуют на промотор Snail2, подавляя его транскрипцию. Механически ацетилированные h4K4 и h4K56 уменьшаются на промоторе Snail2 во время процесса EMT. Таким образом, HDAC1 и HDAC3 эпигенетически подавляют экспрессию Snail2 во время ЭМП клеток печени. В целом, настоящее исследование проясняет возможный сигнальный путь и связывает молекулярные механизмы, с помощью которых HDAC1 и HDAC3 ингибируют EMT, опосредованную Snail2, во время метастазирования HCC.

Материалы и методы

Вирусы и стабильные клеточные линии

Лентивирусный вектор, экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (NC), и лентивирус, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок и Snail2 (Snail2), был приобретен у Hanbio (Китай) и использован в соответствии со стандартными протоколами. Вкратце, клетки HL-7702 инфицировали лентивирусом в среде, содержащей полибрен (2 мг/мл), в течение 24 ч, а затем культивировали в RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и пуромицина (2 мкг/мл) при 37°C при 5% СО ₂ .

Антитела, РНК-интерференция и ингибиторы

Антитела против E-кадгерина (20874-1-AP), N-кадгерина (22018-1-AP) и GAPDH (60004-1-Ig) были приобретены у Proteintech Group (Китай). ). Антитело против Snail2 (sc-166476) было получено от Santa Cruz Biotechnology (США). Ацетилированные антитела h4K4 (C15410322) и h4K56 (C15410213) были приобретены у Diagenode.

Эксперименты по транзиторному нокдауну проводили с использованием миРНК человека для Snail2, HDAC1, HDAC3 и siControl (Gene Pharma, Китай). Клетки HL-7702 трансфицировали указанными киРНК с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine 2000 в соответствии с протоколами производителя. Последовательности миРНК следующие: siSnail2: 5′-GGA CCA CAG UGG CUC AGA AUU-3′; siHDAC1: 5′ – GCU UCA AUC UAA CUA UCA ATT – 3′; siHDAC3: 5′ – GCA CCC GCA UCG AGA AUC ATT – 3′.

Моцетиностат (S1122) и RGFP966 (S7229) были приобретены у Selleck (США). Концентрации моцетинотата и RGF966 составляли 10 мМ в анализе люциферазы и анализе заживления ран.

Количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК из образцов тканей выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США). Количественные данные ПЦР в реальном времени были проанализированы с использованием сравнительного метода Ct, и экспрессия генов-мишеней была нормализована к экспрессии β-актина.

Анализ заживления ран

Анализ заживления ран выполняли как анализ миграционного потенциала клеток, как описано ранее (Liang et al., 2007). Клетки HL-7702 высевали в 6-луночные планшеты (1 ^∗ 10 ⁶ клеток/лунку). Через 24 часа соскребите клеточный монослой по прямой линии, чтобы создать «царапину» наконечником пипетки p200. Удалите мусор и сгладьте край царапины, промыв клетки один раз 1 мл ростовой среды, а затем замените 2 мл 2% эмбриональной бычьей сыворотки RPM1-1640. Ингибиторы добавляли в среду после выскабливания. Ширину раны измеряли под микроскопом (Nikon, DS-U2).

Анализ инвазии

Анализ инвазии через лунку проводили как анализ инвазивного потенциала клеток, как описано ранее (Tiwari and Pattnaik, 2017). Клетки подсчитывали и 2 ^∗ 10 ⁴ клеток высевали во вставки для клеточных культур с размером пор 8,0 мкм, покрытые матригелем (BD Biosciences). Клетки, проникшие через мембрану, покрытую матригелем, через 48 ч фиксировали 95% этанолом, а затем окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым. Кратность изменения инвазии рассчитывали путем деления количества внедряющихся клеток HL-Snail2 на количество внедряющихся контрольных клеток.

Модель метастазирования в печень

Протоколы для животных были одобрены Комитетом по этике ухода и использования лабораторных животных Цзилиньского университета. Самкам голых мышей BALB/c (возраст 6–8 недель, Чарльз-Ривер, Китай) для индуцирования онкогенеза подкожно вводили клетки HL-7702-N (контроль) или клетки HL-Snail2 (5 × 10 ⁵ клеток/мышь; 8 мышей). /группа). Видимые метастатические ткани печени и опухолевые ткани исследовали и заливали в парафин, делали срезы и подвергали H&E.

Анализ люциферазы

Репортерную систему анализа двойного люциферазы (Promega, США) использовали, как описано ранее (Hossan et al., 2016). Клетки HL-7702 котрансфицировали промотором Snail2, содержащим конструкцию люциферазы (pGL3-Bisic, Promega) вместе с плазмидой, экспрессирующей люциферазу Renilla. Активность люциферазы светлячка нормализовали по активности люциферазы Renilla для контроля эффективности трансфекции.

Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP)

Анализы иммунопреципитации хроматина проводили в соответствии с протоколом, описанным ранее (Boyer et al., 2006). Одну 10-сантиметровую чашку (1 × 10 ⁷ ) клеток HL-7702 N и HL-7702 Snail2 выращивали до 90% слияния и использовали для каждого анализа ChIP. IgG использовали в качестве отрицательного контроля. Анализ ChIP проводили по существу, как описано, с использованием антител h4K4ac и h4K56ac. ДНК ChIP подвергали количественной ПЦР. Сигналы как ChIP, так и IgG-антитела были нормализованы к общему входу. Праймерами для промотора Snail2 были: 5′-TAGCTCCCAGAGAGCGTGGA-3′ и 5′-AGGTTCAGATTTCAGCTCCTCC-3′.

Статистический анализ

Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Достоверные различия между двумя группами оценивали с помощью двустороннего критерия Стьюдента t . Значение p ≤0,05 считалось статистически значимым. p ≤0,05, ≤0,01 и ≤0,001 представлены одинарной, двойной и тройной звездочками соответственно.

Результаты

Для ЕМТ, индуцированного TGF-β, требуется Snail2 в клетках печени

Чтобы идентифицировать факторы транскрипции во время ЕМТ, индуцированного TGF-β, мы исследовали время и концентрацию TGF-β1, необходимые для ЕМТ в HL-7702. клетки (дополнительная фигура S1). Основываясь на морфологических изменениях (т. е. клетки подвергаются растворению плотных контактов, разрушению апикально-базальной полярности и рекомбинации структур цитоскелета), которые позволяют клеткам развивать инвазивный фенотип во время ЕМТ, мы подтвердили, что оптимальная концентрация TGF- β1 составлял 10 нг/мл, а время индукции составляло 12 дней (рис. 1А). Как и ожидалось, лечение TGF-β1 приводило к индукции Snail2, приобретению фибробластической мезенхимальной морфологии, подавлению эпителиального маркера (E-кадгерин) и повышению уровня мезенхимальных маркеров (N-кадгерин, виментин и фибронектин) при HL. -7702 клетки (рис. 1B, C). Кроме того, когда мы снизили экспрессию Snail2 в клетках HL-7702 после обработки TGF-β1 через 12 дней, экспрессия E-кадгерина увеличилась, а экспрессия N-кадгерина, фибронектина, виментина значительно снизилась (рис. 1D). На рисунках 1E, F мы обработали клетки TGF-β1 в течение 12 дней, а затем трансфицировали siSnail2; результаты показали, что способности к миграции и вторжению были подавлены, когда Snail2 был нокдаун. Таким образом, Snail2 необходим для индуцированного TGF-β процесса EMT в клетках печени.

Рисунок 1. EMT, индуцированный TGF-β, требует Snail2 в клетке печени. (A) Клетки печени HL-7702 обрабатывали TGF-β1 (10 нг/мл) в течение 12 дней. Морфологические изменения клеток, связанные с ЭМП, показаны на фазово-контрастных изображениях. Масштабная линейка составляла 0,1 мм. (B) Клетки HL-7702 обрабатывали TGF-β1 (10 нг/мл) в течение 12 дней, затем анализировали по относительным уровням мРНК, представленным как среднее значение ± стандартное отклонение. * P ≤ 0,05; *** Р ≤ 0,001. (К) 9Клетки 0178 HL-7702 обрабатывали TGF-β1 (10 нг/мл) в течение 0, 3, 6, 9 и 12 дней, а затем анализировали с помощью вестерн-блоттинга. (D) SiРНК Snail2 (siSnail2) экспрессировали в HL-7702 после обработки TGF-β1 (10 нг/мл) в течение 12 дней, и экспрессию маркеров EMT определяли с помощью qRT-PCR. (E,F) Способность к миграции и инвазии клеток HL-7702, обработанных TGF-β1 (10 нг/мл) в течение 12 дней или трансфицированных siSnail2, анализировали в тестах на заживление ран и инвазию. Данные на гистограмме представлены как среднее ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. Масштабная линейка была 0,2 мм. Был показан репрезентативный эксперимент. ** Р ≤ 0,01.

Snail2 способствует миграции и метастазированию в клетках HCC

Чтобы дополнительно проверить, может ли Snail2 регулировать миграционные и инвазивные способности клеток HL-7702, мы создали клеточную линию со сверхэкспрессией Snail2 (дополнительный рисунок S2). Анализ заживления ран оценивал влияние Snail2 на миграцию клеток. Клетки сверхэкспрессии Snail2 (HL-7702-Snail2) имели значительно более высокую миграцию по сравнению с контрольными клетками (рис. 2А). Кроме того, клетки со сверхэкспрессией Snail2 (HL-7702-Snail2) показали более высокую скорость инвазии (рис. 2B).

Рисунок 2. Snail2 способствует миграции и метастазированию клеток HL-7702. (A,B) Способность к миграции и инвазии клеток HL-7702 (сверхэкспрессирующих Snail2 или контрольных) анализировали в тестах на заживление ран и инвазию. Масштабная линейка была 0,2 мм. Данные на гистограмме представлены как среднее ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. (C) Клетки HL-7702 (сверхэкспрессирующие Snail2 или контрольные) вводили подкожно голым мышам. Сигнал зеленого флуоресцентного белка детектировали с помощью система визуализации in vivo через 30 дней. Было показано количество мышей с отдаленными метастазами через 30 дней после введения сверхэкспрессирующих или контрольных клеток HL-7702 Snail2. (D) Через 30 дней восемь мышей на группу умерщвляли и вырезали печень. Метастатические узлы печени исследовали макроскопически или заливали парафином, разрезали на срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. * Р ≤ 0,05, ** Р ≤ 0,01.

Для проверки миграционных и инвазионных способностей in vivo , мы исследовали, изменяет ли Snail2 туморогенные свойства клеток печени. HL-7702-Snail2 и контрольные клетки вводили подкожно голым мышам. Используя систему визуализации in vivo для обнаружения миграции опухолевых клеток в режиме реального времени, мы обнаружили, что мыши в группе Snail2 демонстрировали более сильный сигнал зеленого флуоресцентного белка, чем в контрольной группе (область сравнения отмечена стрелками), а в группе Snail2 у мышей со сверхэкспрессией было большое количество метастазов в печень по сравнению с контрольной группой (рис. 2C). Это предполагает, что Snail2 может способствовать метастазированию клеток HCC in vivo . Через 30 дней мы наркотизировали и препарировали мышей. Мы обнаружили, что печень мышей, которым вводили клетки HL-7702-Snail2, подвергалась метастазированию и даже некрозу. Окрашивание гематоксилином и эозином показало, что расположение клеток печени мышей, которым инъецировали клетки HL-7702-Snail2, было нерегулярным, не было обнаружено контура и было нечеткое различие между ядром и цитоплазмой (рис. 2D).

HDAC1 и HDAC3 подавляют транскрипцию Snail2 посредством деацетилирования h4K56 и h4K4

Несколько результатов показали, что эпигенетические факторы участвуют в регуляции ингибиторов транскрипции ЕМТ. Затем мы дополнительно изучили потенциальную роль семейства HDAC в контроле активности промотора Snail2 с использованием анализа двойного репортера люциферазы. Как показано на рисунке 3A, котрансфекция вектора экспрессии HDAC1 или HDAC3 приводила к резкому снижению активности промотора Snail2 по сравнению с контрольными клетками, трансфицированными вектором. Напротив, котрансфекция вектора экспрессии siHDAC1 или siHDAC3 приводила к повышению активности промотора Snail2 по сравнению с клетками HDACs, трансфицированными вектором. Кроме того, мы обработали клетки HL-7702, трансфицированные вектором pGL3-Snail2-Luc, моцетиностатом или RGFP9.66, которые специфически ингибируют HDAC1 и HDAC3 соответственно. При обработке клеток ингибиторами активность люциферазы восстанавливалась и была даже больше, чем гиперэкспрессия HDAC, что свидетельствует о прямом подавлении Snail2 с помощью HDAC1 и HDAC3 (рис. 3А).

Рисунок 3. HDAC1 и HDAC3 подавляют экспрессию Snail2 посредством деацетилирования h4K56 и h4K4. (A) клеток HL-7702 были созданы для экспрессии репортерной плазмиды люциферазы, промотора pGL3-Snail2-Luc. Затем клетки трансфицировали вектором промотора pGL3-Snail2 -Luc и плазмидами HDAC1, HDAC3, siHDAC1 или siHDAC3. Моцетиностат или RGFO966 добавляли в среду для роста клеток и через 24 часа анализировали активность люциферазы и нормализовали ее до активности люциферазы Renilla (pRL-SV40), которая служила внутренним контролем. Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение. * P ≤ 0,05; ** Р ≤ 0,01; *** Р ≤ 0,001. Опыты проводили дважды в трехкратной повторности. (B) Ацетилированные h4K4 и h4K56 в промоторе Snail2 анализировали методом иммунопреципитации хроматина (ChIP) (верхняя панель). Образцы ChIP также анализировали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (среднее значение ± стандартное отклонение из трех отдельных экспериментов; нижняя панель). (C) клеток HL-7702 трансфицировали плазмидами HDAC1 или HDAC3. Моцетиностат и RGFO966 добавляли в среду для роста клеток на 24 часа. Затем клетки анализировали в тесте на заживление ран. Масштабная линейка была 0,2 мм. Данные на гистограмме представлены как среднее ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов.

Чтобы подтвердить прямую репрессию Snail2 с помощью HDAC, мы исследовали уровень ацетилирования промотора Snail2 с помощью анализа иммунопреципитации хроматина с использованием стабильных клеток со сверхэкспрессией Snail2. Ацетилированные h4K56 и h4K4 являются основными мишенями HDAC1 и HDAC3. Как показано на рисунке 3B, количество ацетилированных h4K4 и h4K56 было снижено на промоторе Snail2 в HL-Snail2 по сравнению с контрольными клетками. Наши результаты показали, что промоторная область Snail2 была деацетилирована HDAC1 и HDAC3 во время процесса EMT в клетках HCC.

Наконец, мы исследовали, могут ли HDAC1 и HDAC3 влиять на миграцию клеток HL-7702. Как показано на рисунке 3C, по сравнению с контрольными клетками HL-7702 сверхэкспрессия HDAC1 и HDAC3 значительно снижала миграцию. Напротив, обработка ингибиторами HDAC1 и HDAC3 восстанавливала миграционную способность этих клеток до нормального уровня. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что HDAC1 и HDAC3 могут ингибировать опосредованную Snail2 репрессию транскрипции посредством деацетилирования гистонов.

Обсуждение

Запуск ЕМТ активирует основные факторы транскрипции, включая Snail, Twist и ZEB, которые подавляют связанный с ЕМТ маркер, E-кадгерин, и в конечном итоге координируют процесс ЕМТ (Diaz-Lopez et al. , 2014) . В нашем исследовании мы подтвердили, что экспрессия Snail2 увеличивалась во время ЕМТ, индуцированной TGF-β, в клетках HL-7702. Нокдаун экспрессии Snail2 повышал экспрессию E-кадгерина и подавлял экспрессию N-кадгерина, фибронектина и виментина, в то время как избыточная экспрессия Snail2 индуцировала инвазивную миграцию клеток печени in vitro и in vivo.

Широкий спектр генетических и эпигенетических модификаций играет ключевую роль в развитии и онкогенезе рака (Yi et al., 2014). Эти эпигенетические изменения связаны с метилированием ДНК и модификациями гистонов. Более того, существует множество статей, в которых сообщается, что HDAC могут способствовать прогрессированию рака (Wu et al., 2011; Zhang et al., 2019). При раке молочной железы SREBP1 регулирует ЭМП, образуя ко-репрессорный комплекс с HDAC1/2 и Snail1 для подавления E-кадгерина и стимулирования метастазирования опухоли (Zhang et al., 2019).). В другом исследовании сообщалось, что нардилизин контролирует онкогенез кишечника посредством HDAC1/p53-зависимой регуляции транскрипции. Кроме того, взаимодействие между HDAC3 и WDR5 необходимо для ЕМТ, вызванной гипоксией (Wu et al., 2011). Недавно несколько ингибиторов HDAC были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве противоопухолевых препаратов (Garnock-Jones, 2015). К ним относятся Вориностат и Ромидепсин, обладающие противораковой активностью в отношении кожной Т-клеточной лимфомы. Однако мы обнаружили, что HDAC1 и HDAC3 действуют на промотор Snail2, подавляя транскрипцию Snail2. Мы также продемонстрировали, что ацетилированные h4K56 и h4K4, которые являются мишенями HDAC1 и HDAC3 соответственно, были уменьшены на промоторе Snail2 в клетках модели EMT. Прежде всего, наши результаты показали, что HDAC1 и HDAC3 подавляют экспрессию Snail2 посредством деацетилирования h4K56 и h4K4, запуская репрессию EMT, опосредованную Snail2.

В целом, это исследование является первым, обнаружившим противоположную функцию HDAC во время миграции гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) (рис. 4). HDAC могут играть разные роли при разных видах рака, даже при одном и том же раке, и могут участвовать в разных путях, что в конечном итоге приводит к разным результатам. Наше исследование также обращает внимание на возможность использования ингибиторов HDAC в качестве противоопухолевых препаратов для ГЦР.

Рисунок 4. HDAC подавляют экспрессию Snail2 во время ЕМТ. Предлагаемая рабочая модель HDAC1 и HDAC3 эпигенетически подавляет экспрессию Snail2 во время EMT клеток печени, обнаруживая противоположную функцию HDAC во время миграции HCC.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок любому квалифицированному исследователю.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Экспериментальной платформой на животных, Основным центром биологических наук Цзилиньского университета.

Вклад автора

YH разработал эксперименты и написал рукопись. YH, QN и MD провели эксперименты и получили данные. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была поддержана Китайским фондом докторантуры (гранты № 2019M661220 и 2019TQ0114).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00752/full#supplementary-material

Ссылки

Boyer, L.A., Plath, K., Zeitlinger, J., Brambrink, T., Medeiros, L.A., Lee, T.I., et al. (2006). Комплексы Polycomb репрессируют регуляторы развития в мышиных эмбриональных стволовых клетках. Природа 441, 349–353. doi: 10.1038/nature04733

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Брей Ф. , Ферлей Дж., Соержоматарам И., Сигел Р. Л., Торре Л. А. и Джемал А. (2018). Глобальная статистика рака, 2018 г.: оценки GLOBOCAN заболеваемости и смертности во всем мире для 36 видов рака в 185 странах. CA Рак J. Clin. 68, 394–424. doi: 10.3322/caac.21492

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Касас Э. Л., Ким Дж., Бендески А., Оно-Мачадо Л., Вулф С. Дж. и Ян Дж. (2011). Snail2 является важным медиатором индуцированного скручиванием 1 эпителиального мезенхимального перехода и метастазирования. Рак Res. 71, 245–254. doi: 10.1158/0008-5472.can-10-2330

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Диас-Лопес А., Диас-Мартин Дж., Морено-Буэно Г., Куэвас Э.П., Сантос В., Олмеда Д. и др. (2015). Zeb1 и Snail1 участвуют в транскрипционной и эпигенетической регуляции miR-200f во время EMT. Междунар. Дж. Рак 136, E62–E73.

Google Scholar

Диас-Лопес А., Морено-Буэно Г. и Кано А. (2014). Роль микроРНК в переходе от эпителия к мезенхиме и метастазировании и клинические перспективы. Управление раком. Рез. 6, 205–216.

Google Scholar

Форнер А., Лловет Дж. М. и Бруикс Дж. (2012). Гепатоцеллюлярная карцинома. Ланцет 379, 1245–1255.

Google Scholar

Гарнок-Джонс, К.П. (2015). Панобиностат: первое глобальное одобрение. Наркотики 75, 695–704. doi: 10.1007/s40265-015-0388-8

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хоссан Т., Нагараджан С., Баумгарт С. Дж., Се В., Магалланес Р. Т., Эрнандес К. и др. (2016). Гистоновый шаперон SSRP1 необходим для активности сигнального пути wnt во время дифференцировки остеобластов. Стволовые клетки 34, 1369–1376. doi: 10.1002/stem.2287

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кадзита, М., МакКлиник, К.Н., и Уэйд, П.А. (2004). Аберрантная экспрессия факторов транскрипции snail и slug изменяет ответ на генотоксический стресс. Мол. Клеточная биол. 24, 7559–7566. doi: 10.1128/mcb.24.17.7559-7566.2004

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хан, М. И., Хамид, А., Адхами, В. М., Лалл, Р. К., и Мухтар, Х. (2015). Роль эпителиально-мезенхимального перехода в онкогенезе предстательной железы. Курс. фарм. Дес. 21, 1240–1248. doi: 10.2174/1381612821666141211120326

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Li, S., Chen, X., Mao, L., Zahid, K.R., Wen, J., Zhang, L., et al. (2018). Гистондеацетилаза 1 способствует пролиферации и инвазии клеток глиобластомы посредством активации сигнальных путей PI3K/AKT и MEK/ERK. Мозг Res. 1692, 154–162. doi: 10.1016/j.brainres.2018.05.023

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Лян, К.С., Парк, А.Ю., и Гуань, Дж.Л. (2007). Анализ царапин in vitro: удобный и недорогой метод анализа миграции клеток in vitro. Нац. протокол 2, 329–333. doi: 10.1038/nprot.2007.30

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ньето, М. А., Хуанг, Р. Ю., Джексон, Р. А., и Тьери, Дж. П. (2016). ЕМТ: 2016. Моб. 166, 21–45.

Google Scholar

Саид, Н. А., и Уильямс, Э. Д. (2011). Факторы роста в индукции эпителиально-мезенхимального перехода и метастазирования. Клетки Ткани Органы 193, 85–97. doi: 10.1159/000320360

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Шинке Г., Ямада Д., Эгучи Х., Ивагами Ю., Асаока Т., Нода Т. и др. (2018). Роль гистондеацетилазы 1 в отдаленных метастазах рака протоков поджелудочной железы. Науки о раке. 109, 2520–2531. doi: 10.1111/cas.13700

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Soltermann, A., Tischler, V., Arbogast, S., Braun, J., Probst-Hensch, N., Weder, W., et al. (2008). Прогностическое значение экспрессии эпителиально-мезенхимального и мезенхимально-эпителиального переходного белка при немелкоклеточном раке легкого. клин. Рак рез. 14, 7430–7437. doi: 10.1158/1078-0432.ccr-08-0935

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тан, Б., Ци, Г., Тан, Ф., Юань, С., Ван, З., Лян, X., и др. (2016). Аберрантная экспрессия JMJD3 активирует Slug, чтобы способствовать миграции, инвазии и поведению, подобному стволовым клеткам, при гепатоцеллюлярной карциноме. Рак Res. 76, 6520–6532. doi: 10.1158/0008-5472.can-15-3029

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Тьери Дж. П., Аклок Х., Хуанг Р. Ю. и Ньето М. А. (2009). Эпителиально-мезенхимальные переходы в развитии и болезни. Сотовый 139, 871–890. doi: 10.1016/j.cell.2009.11.007

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Тивари А. и Паттнаик Н. (2017). Повышенная экспрессия гена 1 области FSHD снижает миграцию, инвазию и ангиогенез клеток in vitro, что ex vivo поддерживается снижением экспрессии в опухолях. Бионауч. Реп. 37: BSR20171062.

Google Scholar

van Zijl, F., Zulehner, G., Petz, M., Schneller, D., Kornaut, C., Hau, M., et al. (2009 г.). Эпителиально-мезенхимальный переход при гепатоцеллюлярной карциноме. Онкол будущего. 5, 1169–1179.

Google Scholar

Ван Л., Лейте де Оливейра Р., Хьюбертс С., Босдриес Э., Пенчева Н., Брунен Д. и др. (2018). Приобретенная уязвимость лекарственно-устойчивой меланомы с терапевтическим потенциалом. Сотовый 173, 1413.e14–1425.e14.

Google Scholar

Ву, С. Р., Ли, Х. Дж., О, С. Дж., Ким, С., Парк, С. Х., Ли, Дж., и др. (2018). Стабилизация HDAC1 через ось TCL1-pAKT-CHFR является ключевым элементом для NANOG-опосредованной мультирезистентности и стволового фенотипа в опухолевых клетках, подвергнутых иммунному редактированию. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 503, 1812–1818 гг. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.07.118

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ву, М.