Сплит система hek: достоинства и недостатки, отзывы, где купить

Кондиционеры и сплит-системы HEC: отзывы, инструкции и характеристики

Бытовые климатические системы торговой марки Hec выпускаются известным китайским производителем Haier. Первые модели появились на рынке России в 2011 году и завоевали популярность простотой и надежностью конструкции, демократической ценой. Единственная сложность выбора – небольшой ассортимент сплит систем Hec. Но при правильном анализе возможных вариантов всегда можно найти оптимальный.

Содержание

1. Обзор ассортимента
2. Сравнение характеристик популярных моделей
3. Инструкции к пульту управления и кондиционерам HEC
4. Коды ошибок кондиционеров HEC и неполадки
5. Отзывы покупателей

Обзор ассортимента

Вид внутреннего блока

Модельный ряд сплит-систем этой марки не отличается многообразием. Фактически кондиционеры Hec — это слегка модернизированная бюджетная серия Haier. Форма и цвет стандартные – белый внутренний блок со слегка скругленными краями. Наружный не отличается оригинальным дизайном, но благодаря грамотной компоновке надежен.

Выбор необходимо делать по области применения – для квартиры, офиса или другого служебного помещения. Серия 203 последняя в линейке моделей и характеризуется следующими особенностями в зависимости от вида:

• HDR R Наиболее доступная по стоимости сплит система Hec. Для оптимизации контроля работы внедрено 6 режимов в зависимости от внешних параметров в помещении – температура воздуха, влажность. Они выставляются вручную, автоматика отсутствует.
• HNB, HNC и HNA R2. Характеризуются большим выбором по мощности, но конструктивно ничем не отличаются от вышеописанной модели. Преимущество – встроен более продуктивный воздушный фильтр.
• Серия DB. Это инверторные сплит-системы, разработанные только для мощных моделей. Положительные моменты – экономия расхода электроэнергии и минимальные показатели испарения хладагента.

Для унификации производителем используется единый пульт управления. В зависимости от модели некоторые кнопки управления могут быть неактивны. Этот момент нужно уточнять у продавца перед покупкой.

Регулировку жалюзи в горизонтальном направлении (влево/вправо) можно выполнить только вручную. Поэтому внутренний блок не должен располагаться слишком высоко на стене комнаты.

Сравнение характеристик популярных моделей

Вид наружного блока

Для выбора оптимальной модели сплит системы Hec рекомендуется в первую очередь обращать внимание на технические характеристики. Дизайн внутренних блоков стандартный и может хорошо вписаться в интерьер квартиры, офиса или рабочей комнаты, что видно на фото в каталоге. Учитывая, что страна-производитель Китай – к внешнему осмотру во время покупки и контролю работы в течение гарантийного периода нужно подойти внимательно.

Для сравнения моделей рекомендуется изучить следующие параметры:

• мощность охлаждения, нагрева;
• режимы – автозапуск, таймер;
• класс энергопотребления;
• уровень шума во время работы;
• габариты внутреннего блока;
• требования к минимальной и максимальной температуре на улице;
• стоимость.

Для упрощения задачи можно ознакомиться с действующими параметрами, а также ценой, указанными в таблице.

Характеристика/модель	HEC-07HND203/R2	HEC-09HNC203/R2	HEC-12HNC203/R2
Мощность обогрев/охлаждение	2000/2000	2380/2500	3800/3570
Потребляемая мощность	765/670	780/740	1030/990
Класс энергопотребления	D	A	A
Уровень шума	38/33/29	39/35/30	40/35/31
Min температура на улице	-7°С	-7°С	-15°С
Габариты внутреннего блока	795*196*265	795*196*265	795*196*265
Расход воздуха	400	450	500
Стоимость	14990	15990	17990

Во всех системах используется хладагент R410A. Он безопасен для здоровья человека, в случае протечки не повлияет на обстановку в помещении. Но для корректной работы сплит-системы необходимо поддерживать оптимальный уровень жидкости.

Во время обслуживания климатической системы необходимо дополнять только хладагент, рекомендуемый производителем. Если выбрана другая марка – предварительно очищаются магистрали, выполняется продувка.

Инструкции к пульту управления и кондиционерам HEC

Каждая система Hec комплектуется универсальным пультом дистанционного управления. Он характеризуется удобной, эргономической формой, производитель позаботился о наличии жидкокристаллического дисплея. На нем отображаются текущие параметры работы.

Пульт ДУ Функции пульта Режимы работы

 

Инструкция к пульту прилагается с технической документацией по эксплуатации. С помощью этого устройства можно делать следующее:

• установка текущей даты, таймера;
• корректировка режима работы;
• изменение направления движения охлажденного воздуха в горизонтальной плоскости;
• переход в режим Sleep;
• блокировка, исключающая случайное нажатие копок.

В некоторых моделях предусмотрен режим автоматической работы Auto. Корректировка охлаждения (нагрева) выполняется в зависимости от текущей температуры в комнате. О наличии этого режима следует узнать заранее.

Коды ошибок кондиционеров HEC и неполадки

В процессе работы сплит-системы возможно возникновение неполадок. Их следует разделить на две категории – сбои в работе и глобальная поломка. В последнем случае необходимо вызвать специалиста для решения проблемы. В инструкции производитель описал некоторые типы неисправностей и методы их решения, но коды ошибок в инструкции к R2 Хек не указаны, т.к. отсутствует система самодиагностики.

 

При возникновении неисправностей необходимо сделать следующее.

1. Повторно изучить инструкцию.
2. Убедиться, что проблема не устранилась после повторного включения.
3. Действовать согласно рекомендациям производителя.
4. Нельзя самостоятельно разбирать блок, за исключением очистки воздушного фильтра.

Независимо от того, какой уровень квалификации у покупателя – гарантия будет автоматически аннулирована при нарушении правил эксплуатации. Лучше вызвать специалиста для профессиональной оценки неполадок, и при этом сохранить гарантию.

Отзывы покупателей

Перед покупкой рекомендуется выполнить комплексный анализ сплит системы Hec, отзывы покупателей помогут сформировать объективное мнение о работе. Примечательно, что ни одно мнение владельцев не указывало, что внутренний блок плохо охлаждает.

При этом покупатели указывали такие положительные моменты:

• доступная цена;
• отсутствие вибрации во время работы;
• на дисплее отображается температура в комнате;
• качественная сборка.

Но есть и недостатки:

• короткий шнур питания;
• ручная регулировка бокового направления воздушного потока;
• небольшой жидкокристаллический экран на пульте д/у.

В целом климатические системы этого класса полностью оправдывают свою стоимость. Они достаточно надежны, но в то же время небольшое число функций является их недостатком.

Помимо выбора лучшей модели нужно правильно выполнить монтаж. В видеоматериале специалист расскажет об основных нюансах установки и обслуживания:

Кондиционер Haier HEC-07 HND 03/R2

Срок гарантии на монтаж (лет) 5

Размещение Внутреннее и наружное

Таймер Да

Бренд Haier

Нагреватель Да

Наличие Снят с производства

Наличие фильтрации: Да

Уровень шума (внутренний блок/внешний блок), дбА: 39/59

Максимальная длинна трассы, м: 15

Наличие таймера: Да

Wi-Fi Нет

Максимальный перепад высот, м: 10

Система самодиагностики: Да

Наличие дисплея: Есть

Вес внутреннего блока, кг: 7.

7

Тип кондиционера: Сплит-система

Рекомендуемая площадь помещения, м.кв.: 21

ПДУ: Есть

Вес внешнего блока, кг: 22

Тип компрессора: Инвертор

Управление потоками с пульта: Да

Габариты (внутренний блок/наружный блок), мм. : 795*265*187/695*430*245

Холодопроизводительность, BTU/час: 6 828.850

Режим работы: Да

Производительность по воздуху, м.куб./час: 400

Теплопроизводительность, BTU/час: 6 828. 850

Ночной режим: Да

Тип хладагента: R410A

Потребляемая мощность (охлаждение/обогрев), Вт.: 765/670

Режим осушения: Да

Диапазон рабочих температур (охлаждение/обогрев), °С +18. .+43/-7..+24

Электропитание, В/Гц: 220-240/50

Haier HSU-24HEK203 / R2(DB) new: характеристики, описание

Кондиционеры Haier › Настенные кондиционеры › HSU-HEK › HSU-24HEK203 / R2(DB) new

Скидку на оборудование и монтаж рассматриваем индивидуально.
Отправьте запрос или позвоните нам по телефону 8 (495) 197-76-88, чтобы получить наше коммерческое предложение.

Цена комплекта: отправить запрос

Купить

Сравнить

Цены на монтаж.

Haier HSU-24HEK203 / R2(DB) new предлагаем Вам купить с установкой, официальной гарантией 5 лет и предложением дальнейшего обслуживания. Консультации по кондиционерам и другому климатическому оборудованию Haier Вы можете получить, позвонив по телефону 8 (495) 197-76-88 (Пн-Пт: 09:00 — 18:00).

Модель Haier HSU-24HEK203 / R2(DB) new — это прекрасный выбор с возможностью получить индивидуальную скидку официального дистрибьютора в Москве, обращайтесь к нам.

Доставка и оплата: по Москве — доставка бесплатная, по России — определяется индивидуально. Возможен самовывоз. Способы оплаты: наличные, безналичный расчет, карты Visa и Mastercard, Яндекс-деньги.

Получить коммерческое предложение

Для юридических лиц:

• Оплата по безналу без наценки.
• Укомплектуем Ваш объект всем необходимым требованиям.
• Подготовим сопроводительные документы.

Технические характеристики модели HSU-24HEK203 / R2(DB) new

Мощность охлаждения, кВт	7.1
Мощность обогрева, кВт	7.6
Страна бренда	Китай
Название производителя	Китай
Компрессор	Инвертор
Площадь, м²	70
Режим работы	Холод/тепло
Потребление электроэнергии при охлаждении, кВт	2,2
Потребление при обогреве, кВт	2,3
Охлаждающая способность, тыс. BTU	24
Диапазон температур на охлаждение, С	+18…+43
Диапазон температур на обогрев, С	-15…+24
Расход воздуха, м3/ч	1100
Хладагент	R410A
Максимальная длина трассы, м	25
Диаметр газовой трубы, дюйм	5/8
Диаметр жидкостной трубы, дюйм	1/4
Фильтр тонкой очистки	Да
Предварительный фильтр	Да
Самоочистка внутреннего блока	Да
Функция авторестарта	Да
Самодиагностика	Да
Пульт Д/У	Да
Цвет	Белый
Дисплей	Да
Ночной режим	Да
Авто режим	Да
Напряжение питания, В	220
Сила тока, А	10,9
Гарантия производителя	3 года
Уровень шума внешнего блока, дБа	54
Габариты внешнего блока (ВхШхГ), см	81×68,8×28,8
Вес внешнего блока, кг	47
Высота внешнего блока, см	68,8
Ширина внешнего блока, см	81
Глубина внешнего блока, см	28,8
Уровень шума внешнего блока, дБа	37
Габариты внутреннего блока (ВхШхГ), см	104,6×29,9×23,9
Вес внутреннего блока, кг	13
Высота внутреннего блока, см	29,9
Ширина внутреннего блока, см	104,6
Глубина внутреннего блока, см	23,9

Описание модели

Настенная сплит-система HSU-24HEK203/R2(DB) – это новинка 2014 года от бренда Haier (Хайера). Выход на заданную температуру происходит в короткое время благодаря применению современной технологии DC-Inverter со 180° синусоидальным током. Данная модель оснащена функцией осушения воздуха, что позволяет удалить излишнюю влажность в помещении. Благодаря низким шумовым показателям, представленную модель можно разместить в спальных комнатах. Управление работой кондиционера осуществляется пультом дистанционного управления.

Основные характеристики рассматриваемой модели:

Свое начало история компании Haier берет в 1984 году. С самого первого дня и по сей день самое большое внимание на производстве уделяется качеству выпускаемой продукции. Все товары проходят строгий контроль перед тем, как покинуть заводы. Наверное, поэтому, корпорация уже не раз получала награду, как крупнейший в мире производитель качественной бытовой техники. Кондиционеры Haier – это всегда инновационный подход к созданию идеального климата в помещениях, который учитывает современный ритм жизни человека.

О кондиционерах Haier

Кондиционеры Haier пришли на российский рынок в 2007 году. Именно тогда российские потребители познакомились с продукцией бренда на Национальной выставке Китая в России. В основном, это была крупная бытовая техника. На тот момент компания уже была известна всему миру как глобальная корпорация, которая располагает производственными площадками и научно-исследовательскими центрами в Европе, Северной Америке, Азии, на Ближнем Востоке и в Африке. Сегодня бытовые и промышленные кондиционеры Haier ассоциируются у клиентов с безупречным качеством, профессиональным сервисом и разумными ценами.

Помощь в подборе оборудования:

8 (495) 197-76-88

E-mail:
[email protected]

Отправить заявку

Отправьте заявку

Приложить файлы

Отправить запрос

При какой минусовой температуре кондиционер работает на обогрев и охлаждение

Современные сплит-системы можно эффективно использовать не только для спасения от летнего зноя, но и для создания комфортного микроклимата в квартире зимой, если в этом есть необходимость. Однако, включая его в холодное время года, следует учитывать ряд важных нюансов – это позволит обеспечить безопасную и надежную работу устройства.

Неграмотное применение сплит-систем в зимнее время года влечет за собой скорый выход оборудования из строя. В первую очередь страдают дренажная система и компрессор. По этой причине нужно предельно осторожно и внимательно выставлять рабочие характеристики на устройстве.

Принцип работы современных сплит-систем

Все климатические устройства работают по одному принципу, основывающемуся на свойстве жидкостей выделять тепло при конденсации и поглощать его при испарении. Изначально все производимые системы работали только на охлаждение, но сегодня большинство из них оснащены еще и функцией обогрева.

На фото: Принцип работы кондиционера

Работа кондиционера строится на функционировании замкнутой системы: компрессор, конденсатор и испаритель соединяются между собой трубками из меди, образующими холодильный контур. По этому контуру непрерывно движется хладагент, преобразуясь из газообразного состояния в жидкое и наоборот. При работе оборудования на охлаждение фреон попадает сначала в конденсатор, а затем в испаритель, где он снова преобразуется в газ и поглощает тепло от воздуха в помещении, после чего направляется во внешний блок, откуда передает энергию окружающей среде. При работе на обогрев, благодаря специальному клапану, процесс происходит в обратной последовательности – от испарителя к конденсатору с переходом газа в жидкое состояние.

Работа кондиционера зимой в режиме обогрева

Теперь перейдем к главному и выясним, можно ли запускать сплит-систему на обогрев помещения, когда на улице значительный «минус».

При каких внешних температурах возможна работа в режиме обогрева

Большинство современных кондиционеров могут работать на обогрев только при условии, что температура за окном не ниже -7°C…-15°C. Более точную информацию по нижнему температурному порогу можно найти в инструкции к устройству.

Если же использовать устройство при более низких показателях термометра, мощность обогрева будет меньшей. Кроме того, возникнет угроза обледенения дренажной системы и конденсатора, что неизбежно ведет к поломке всей сплит-системы.

На фото: Принцип работы современных сплит-систем

Но в зависимости от хладагента и типа компрессора, некоторые кондиционеры могут работать в режиме обогрева и при более низких температурах, например, -15°C…- 30°C. Речь идет о передовых моделях инверторных сплит-систем.

По каким причинам кондиционер не работает на обогрев

Если в устройстве предусмотрена возможность работы на обогрев помещения, но он не включается в этот режим, возможно произошла поломка компрессора, дренажной системы или клапана, обеспечивающего переключение холодильного контура на обогрев. Также есть вероятность утечки хладагента в местах спайки трубок. В этом случае стоит вызвать мастера по ремонту климатического оборудования.

Еще одна популярная причина – температура за окном ниже допустимого минимума, поэтому кондиционер может лишь незначительно повысить уровень тепла в комнате.

Если же прибор нормально работает, но воздух в помещении не нагревается, то, возможно, стоит просто немного подождать – иногда системе требуется дополнительное время, чтобы внутренний блок прогрелся. Зимой это вполне нормальное явление.

Также помочь разобраться в причинах неисправности может дисплей внутреннего блока, который высвечивает коды ошибок в работе сплит-системы.

Если же самостоятельно установить и устранить проблему не получается, лучше обратиться в специализированный сервисный центр.

Работа кондиционера зимой в режиме охлаждения

Охлаждение помещения с помощью сплит-системы допустимо только при условии, что температура снаружи не ниже +16°C или соответствует другим допустимым значениям, указанным в руководстве по эксплуатации оборудования. Во всех остальных случаях включение кондиционера с целью понижения температуры в комнате запрещено и грозит образованием льда и утечка воды из внутреннего блока.

На фото:Образование льда и утечка воды из внутреннего блока.

Если же есть необходимость поддерживать низкую температуру даже в зимний период, то лучше установить специальную систему, способную работать при более широких показателях температурных значений.

Еще один вариант – доработать кондиционер специальным зимним комплектом, который предоставит большие возможности по эксплуатации устройства в холодное время.

Что такое зимний комплект и для чего он нужен

Зимний комплект – это набор специальных устройств, обеспечивающих безопасную работу кондиционера при температурах ниже диапазона, заданного производителем. В него входят картерный подогрев, дренажный подогрев, регулятор скорости вентилятора. С помощью этих приборов предотвращаются оледенение дренажной системы, образование наледи на корпусе, загустение масла и переохлаждение фреона.

На фото: Зимний комплект для кондиционера Dantex

Но используя зимний комплект, очень важно не забывать, что кондиционеры, оснащенные им, могут работать лишь на охлаждение. Обогрев в данном случае возможен лишь в границах температур, обозначенных в технических характеристиках устройства.

Какие системы могут работать в режиме обогрева в зимний период

На современном рынке представлено оборудование, которое можно безопасно включать зимой в режим обогрева – даже когда температура опускается до -15°C…-30°C. Это сплит-системы инверторного типа. От стандартных кондиционеров их отличает наличие инверторного компрессора, который обеспечивает регулирование производительности. Использование инверторного компрессора с EVI-впрыском пара хладагента и ресивера позволяет достичь стабильной работы при очень низких температурах окружающей среды – у некоторых моделей предусмотрена работа при -30 °C.

Готовим кондиционер к зиме

В рамках подготовки устройства к зимнему сезону нужно провести ряд профилактических мероприятий.

Необходимо просушить внутренний блок от скопившегося конденсата. Для этого кондиционер надо сначала включить на некоторое время на охлаждение, а затем на такой же период запустить на обогрев. Почистить встроенные фильтры от скопившейся пили и грязи. Если позволяют условия, установить на внешний блок защитный козырек.

Если в помещении стоит стандартный бытовой кондиционер, то лучше ограничиться включением его в режиме обогрева лишь в период межсезонья – пока температура не опустилась ниже предельных значений, установленных производителем.

Заключение

Кондиционер может эффективно использоваться в зимнее время, однако исключительно в пределах температур, заданных производителями. Зимний комплект позволит опустить нижнюю границу этого предела, но лишь для работы в режиме охлаждения воздуха. Обогрев возможен, как правило, только при температуре снаружи не ниже -7 °C для большинства бытовых кондиционеров, поэтому не следует использовать их как основной источник отопления. Если же необходимо обеспечить работу кондиционера при более низких показателях температуры окружающей среды, лучше обзавестись инверторной сплит-системой, предоставляющей более широкие возможности.

Бренд Haier Electric Company

Haier Electric Company

В 1920-х для поддержки внутреннего китайского рынка был построен «Завод холодильников Циндао». После Китайской революции 1949 года завод был национализирован и стал государственным предприятием. К 1980 году завод имел долг, превышающий 1,4 млн юаней, страдал из-за разрушенной инфраструктуры, слабого управления и отсутствия контроля качества. Объём производства снижался и редко превышал 80 холодильников в месяц. Завод находился на грани банкротства.

С началом «политики реформ и открытости» в 1979 году в КНР начали образовываться совместные предприятия с западными партнёрами. Китайским рынком заинтересовался крупнейший производитель бытовой техники в Германии Liebherr, продавший заводу в Циндао технологии и оборудование для производства холодильников. Главой предприятия в 1984 году правительство Циндао назначило молодого ассистента представителя городской администрации, Чжана Жуйминя, ответственному за ряд городских предприятий по производству техники. 26 декабря 1984 года на основе завода была создана «Холодильная компания Циндао» (Qingdao Refrigerator Co.).

Чжан был страстным поклонником западных и японских бизнес-практик и техник управления. Став управляющим, он быстро осознал, что слабое состояние контроля качества ставит под угрозу дальнейшую конкурентоспособность и выживание завода. В 1985 году один из покупателей вернул сломанный холодильник на завод и предъявил его Чжану. Тогда Чжан провёл покупателя по всему складскому запасу из 400 холодильников в поисках подходящей замены. В процессе он обнаружил, что процент брака составляет 20 %. Чтобы подчеркнуть важность качества продукции, Чжан отобрал 76 сломанных холодильников и выстроил их в ряд на полу завода. Затем он раздал рабочим кувалды и приказал расколотить холодильники. Рабочие не решались на этот шаг — стоимость холодильника в то время составляла около двух их годовых зарплат. Увидев колебания, Чжан заявил: «Уничтожьте их! Если мы допустим 76 холодильников к продаже, мы продолжим ошибаться, и это разорит нашу компанию». Холодильники разнесли на куски. Один из молотков до сих пор хранится у главы корпорации.

Установка оборудования Liebherr и введение немецких технологий сопровождались строгими обязательствами, касающимися качества. В компании начались положительные изменения. К 1986 году компания стала приносить прибыль, а продажи росли в среднем на 83 % в год, с 3,5 млн китайских юаней в 1984 году до 7 млрд в 2002 году. Глядя на успехи «Холодильной компании Циндао», городское правление попросило руководство компании принять на баланс других городских производителей бытовой техники, находящихся в упадочном состоянии. В 1988 компания взяла под управление Циндаоскую гальваностегическую компанию (производителя микроволновых печей) и в 1991 году — Циндаоский завод по производству кондиционеров и холодильных установок. В связи с расширением название компании в 1991 году было изменено на Qingdao Haier Group; слово Haier было образовано от китайского варианта передачи названия германского партнёра Liebherr (Lieberhaier). В следующем году название было упрощено до Haier Group.

В 1993 году была создана дочерняя компания Qingdao Haier Refrigerator, акции которой были размещены на Шанхайской фондовой бирже; это принесло около 370 млн юаней на дальнейшее развитие. Заняв к середине 1990-х годов прочные позиции на внутреннем рынке, Haier начала выход на международную арену. Компания открыла производство в Индонезии в 1996 году, в Филиппинах и Малайзии в 1997 году. Также в этот период Haier вышла на рынок США, заняв свободные ниши минихолодильников для гостиничных номеров и систем охлаждения для винных погребов. Воодушевлённая успехом, Haier решила выйти на американский рынок полноразмерных холодильников, где господствовали General Electric, Whirlpool Corporation, Frigidaire и Maytag, разместив в 1999 году производство в Камдене, Южная Каролина. Параллельно компания поглощала других китайских производителей, таких как основной конкурент в Циндао Red Star Electric Appliance Factory и производитель телевизоров Huangshan Electronics Group. К концу 1990-х годов в Китае на компанию приходилось 40 % продаж холодильников, 36 % стиральных машин и 37 % продаж кондиционеров.

В 2000-х Haier продолжила международную экспансию, в 2002 году был открыт завод в Пакистане, в 2003 — в Иордании. В 2004 году компания довела свою долю в совместном предприятии Haier-CCT Holdings Ltd. до уровня контрольного пакета, примечательна эта компания было листингом на Гонконгской фондовой бирже (впоследствии переименована в Haier Electronics Group).

Haier Building на Манхеттене
К 2002 году выручка Haier в США достигла $200 млн (от $7 млрд в целом). Haier поставила перед собой цель достичь показателя в 1 млрд и получить долю в 10 % от американского холодильного рынка. Также в 2002 году Haier приобрела для себя здание в центре Манхэттена. Ранее его занимал Greenwich Savings Bank. Здание общей площадью 4800 м² было построено в 1924 году в неоклассическом стиле.

Haier имеет заводы в пяти африканских странах: Тунис, Нигерия, Египет, Алжир и ЮАР.
Компания также приобрела завод в Италии. Имеет дистрибуцию в большинстве ведущих европейских розничных сетей как под собственным брендом так и под брендом иностранных партнёров.

На 2008 год Haier была второй в мире после Whirlpool Corporation по объёму производства холодильников, а также крупнейшим брендом бытовой техники на китайском рынке (согласно Euromonitor). В 2011 году компания вышла на первое место в мире по объёму продаж бытовой техники, доля Haier в 2015 году на мировом рынке достигла 9,8 % (источник — Euromonitor International Limited). В 2013 году международная инвестиционная компания приобрела 10-процентный пакет акций Qingdao Haier[8].

В 2012 году компания купила новозеландского производителя бытовой техники Fisher & Paykel. В 2016 году Haier заплатила $5,4 млрд за подразделение бытовой техники General Electric GE Appliances; оборот этого подразделения в 2014 году составил $5,9 млрд, в нём работало 12 тысяч человек, почти все в США. Оно стало отдельной структурой в составе группы Haier, его штаб-квартира осталась в Луисвилле (Кентукки). 22 апреля 2016 года Haier запустил завод по производству холодильников в России в городе Набережные Челны. В 2018 году была поглощена итальянская компания Candy. В 2019 году основная дочерняя компания группы была переименована в Haier Smart Home.





Haier HSU-24HEK203 R2(DB) new: цена и характеристики кондиционера

Кондиционеры Haier › Настенные кондиционеры › HSU-HEK ›

Цена: чтобы узнать цену на HSU-24HEK203 / R2(DB) new, пожалуйста, отправьте нам быстрый запрос, и менеджер вышлет цену на эту модель в кратчайшие сроки!

Скидку на оборудование и установку мы обсудим с Вами индивидуально. Цены на монтаж.

Купить

Отправьте запрос

Если нет в наличии, предложим аналоги

Бесплатная доставка по Москве.

Гарантия — 3 года.

Мощность охлаждения: 7.1 кВт.

Обслуживаемая площадь: ≈ 71 м².

Серия: Haier HSU-HEK

Haier HSU-24HEK203 / R2(DB) new Вы можете купить в Москве, позвонив по телефону +7 (495) 198-04-72. Если Вы ещё не уверены в выборе, наши специалисты бесплатно проконсультируют Вас по оборудованию Haier!

Условия доставки: по Москве — доставка бесплатная, по России — определяется индивидуально. Возможен самовывоз. Способы оплаты: наличные, безналичный расчет, карты Visa и Mastercard.

Технические характеристики модели HSU-24HEK203 / R2(DB) new

Сравнить с другими моделями

Мощность охлаждения, кВт	7.1
Мощность обогрева, кВт	7.6
Страна бренда	Китай
Производитель	Китай
Компрессор	Инвертор
Площадь, м²	70
Режим работы	Холод/тепло
Потребление при охлаждении, кВт	2,2
Потребление при обогреве, кВт	2,3
Охлаждающая способность, тыс. BTU	24
Диапазон t на охлаждение, С	+18…+43
Диапазон t на обогрев, С	-15. ..+24
Расход воздуха, м3/ч	1100
Хладагент	R410A
Max длина трассы, м	25
ø газовой трубы, дюйм	5/8
ø жидкостной трубы, дюйм	1/4
Фильтр тонкой очистки	Да
Предварительный фильтр	Да
Самоочистка внут блока	Да
Авторестарт	Да
Самодиагностика	Да
Пульт Д/У	Да
Дисплей	Да
Цвет	Белый
Ночной режим	Да
Авто режим	Да
Напряжение, В	220
Сила тока, А	10,9
Гарантия	3 года
Внешний блок / Уровень шума, дБа	54
Внешний блок / Габариты (ВхШхГ), см	81×68,8×28,8
Внешний блок / Вес, кг	47
Внешний блок / Высота, см	68,8
Внешний блок / Ширина, см	81
Внешний блок / Глубина, см	28,8
Внутренний блок / Уровень шума, дБа	37
Внутренний блок / Габариты (ВхШхГ), см	104,6×29,9×23,9
Внутренний блок / Вес, кг	13
Внутренний блок / Высота, см	29,9
Внутренний блок / Ширина, см	104,6
Внутренний блок / Глубина, см	23,9

Описание

Настенная сплит-система HSU-24HEK203/R2(DB) – это новинка 2014 года от бренда Haier (Хайера). Выход на заданную температуру происходит в короткое время благодаря применению современной технологии DC-Inverter со 180° синусоидальным током. Данная модель оснащена функцией осушения воздуха, что позволяет удалить излишнюю влажность в помещении. Благодаря низким шумовым показателям, представленную модель можно разместить в спальных комнатах. Управление работой кондиционера осуществляется пультом дистанционного управления.

Основные характеристики рассматриваемой модели:

Свое начало история компании Haier берет в 1984 году. С самого первого дня и по сей день самое большое внимание на производстве уделяется качеству выпускаемой продукции. Все товары проходят строгий контроль перед тем, как покинуть заводы. Наверное, поэтому, корпорация уже не раз получала награду, как крупнейший в мире производитель качественной бытовой техники. Кондиционеры Haier – это всегда инновационный подход к созданию идеального климата в помещениях, который учитывает современный ритм жизни человека.

Все модификации серии HSU-HEK

Модель	Обслуживаемая площадь	Мощность охлаждения
HSU-24HEK203 R2(DB) new	≈ 71 м2	7.1 кВт	запросить цену	Купить Сравнить

Характеристики серии

 

Помощь в подборе оборудования Haier

Отправьте проект, план или смету на расчет:

Приложить файлы

Отправить запрос

Нажимая на кнопку “Отправить запрос”, вы принимате пользовательское соглашение.

Split Intein-Mediated Protein Ligation для обнаружения межбелковых взаимодействий и их ингибирования

• Список журналов
• Нац Коммуна
• PMC7229206

Нац. коммун. 2020; 11: 2440.

Опубликовано в сети 15 мая 2020 г. doi: 10.1038/s41467-020-16299-1

, ¹ , ¹ , ² , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ³ , ^{3, 4, 5, 6} , ² and ^{1, 7, 8, 9}

Author information Article notes Copyright and License information Disclaimer

Supplementary Materials

Data Availability Statement

Здесь, чтобы преодолеть многие ограничения, связанные с текущими доступными методами для обнаружения белок-белковых взаимодействий (PPI), мы разработали метод живых клеток под названием Split Intein-Mediated Protein Ligation (SIMPL). В этом подходе белки-приманки и белки-жертвы соответственно сливаются с N-концевым фрагментом (IN) и С-концевым фрагментом (IC) интеина, полученными из реконструированного расщепленного интеина GP41-1. Связывание приманки и жертвы восстанавливает интеин, который соединяет пептиды приманки и жертвы в единый интактный белок, который можно обнаружить с помощью обычных методов обнаружения белков, таких как вестерн-блот-анализ и ИФА, служащих для считывания PPI. Этот метод надежен и может применяться не только на клеточных линиях млекопитающих, но и на животных моделях, таких как С. элегантный . SIMPL демонстрирует высокую чувствительность и специфичность и позволяет исследовать ИПП в различных клеточных компартментах и ​​отслеживать кинетические взаимодействия. Кроме того, мы создаем платформу SIMPL ELISA, которая обеспечивает высокопроизводительный скрининг ИПП и их ингибиторов.

Тематические термины: Сети белок-белковых взаимодействий, Высокопроизводительный скрининг, Протеомный анализ, Сети белок-белковых взаимодействий, Скрининг

Белок-белковые взаимодействия (PPI) составляют множество фундаментальных этапов в большинстве биологических процессов ¹ . Таким образом, обнаружение и анализ ИПП необходимы для понимания молекулярных механизмов биологических процессов, выяснения механистических деталей возникновения и прогрессирования заболевания, а также для разработки новых методов лечения и диагностики.

Для обнаружения ИЦП ^{1 , 2} были разработаны многочисленные методы. Однако, основываясь на основополагающих принципах их разработки, эти методы дают погрешность для определенных наборов ИЦП и сопровождаются ограничениями ³ . Например, стабильные ИПП часто легко отслеживать с помощью различных методов, но гораздо труднее обнаружить переходные и слабые ИПП, играющие важную регулирующую роль. ИПП, возникающие в некоторых особых клеточных местах, также можно исследовать только с помощью специальных методов. Кроме того, некоторые подходы восстанавливают ИПП в модельных организмах, таких как дрожжи ⁴ , что может неточно отражать нативную физиологическую среду, в то время как методы, основанные на аффинной очистке, обычно необъективны из-за чрезмерного представления обильных белков и недостаточного представления слабых ИПП, которые легко теряются. во время очистки. Многие методы также страдают от низкой количественной оценки или пропускной способности.

В этом исследовании мы разрабатываем метод обнаружения PPI, называемый лигированием белков, опосредованным расщеплением белка (SIMPL). В этом подходе расщепленный интеин используется в качестве сенсора белковых взаимодействий. Интеин представляет собой белковый фрагмент, обладающий ферментативной активностью, которая позволяет ему отделяться от исходного пептида при лигировании (через образование пептидной связи) фланкирующих участков белка (называемых N-концевым экстеином (EN) и С-концевым экстеином). экстеин (EC)) в новый интактный пептид с помощью процесса, называемого сплайсингом белков (дополнительная рис. 9).0015 1 ) ^{5 , 6} . Интеины обычно небольшие или могут быть уменьшены до небольшого домена, близкого к 100 аминокислотам. Их функция не требует каких-либо кофакторов или источников энергии, и они обычно могут работать в относительно широких условиях окружающей среды. Интересно, что интеин может быть разделен на две части как естественным, так и искусственным путем без ущерба для его активности и, таким образом, для транс-сплайсинга белков ⁷ , что делает такие расщепленные интеины привлекательными инструментами в биотехнологических областях ⁸ . Те же функции также позволили нам настроить систему SIMPL.

Здесь мы описываем дизайн и реализацию SIMPL, основанного на расщеплении интеина живых клеток метода обнаружения PPI, который позволяет анализировать in situ взаимодействия, происходящие в различных клеточных компартментах, а также их реакцию на фармакологические воздействия, такие как ферментативные и PPI. ингибиторы.

Дизайн и упрощение SIMPL

В нашем дизайне (рис. ) белок-приманка слит на своем С-конце с меткой V5 и N-концевым фрагментом интеина (IN). Соответственно, белок-жертва слит на своем N-конце с меткой FLAG и С-концевым фрагментом (IC) интеина. Приманка и жертва совместно экспрессируются в выбранных клетках млекопитающих для изучения их взаимодействия in vivo. Ассоциация приманки и жертвы сближает IN и IC, позволяя им восстановить полностью функциональный интеин, который затем катализирует свое собственное вырезание и одновременное лигирование пептидов приманки и добычи (а также тегов V5 и FLAG). . Полученный сплайсированный белок может быть разрешен с помощью обычного вестерн-блоттинга из-за его измененной подвижности, а наличие меток V5 и FLAG позволяет визуализировать или очищать белок с использованием обычных биохимических методов.

Открыть в отдельном окне

Разработка теста SIMPL.

a Схема SIMPL для обнаружения PPI. b Схематическое представление конструкций SIMPL-приманки и добычи и повторное разделение интеина GP41-1. c Исследование системы SIMPL с расщепленным интеином GP41-1 с разными сайтами расщепления. ДНК-конструкции, кодирующие FRB-IN и IC-FKBP1A с расщепленными по сайтам интеинами, экспрессировали в клетках HEK 293. После инкубации с рапамицином (100 нМ) в течение 2 ч клетки лизировали и лизаты подвергали вестерн-блоттингу с антителами α-V5 и α-FLAG. Как IN, так и IC конструкции с расщеплением C25 продемонстрировали наилучшие характеристики и были приняты в качестве стандартного сенсорного интеина для платформы SIMPL. Блот представляет четыре независимых эксперимента. d Доза-ответ рапамицин-индуцированного взаимодействия FRB/FKBP1A, изученного с помощью SIMPL. Клетки HEK 293, экспрессирующие FRB-IN и IC-FKBP1A, обрабатывали указанными дозами рапамицина в течение 2 ч с последующим вестерн-блоттингом. Плотность сплайсированных полос (FRB-FKBP1A) была количественно определена с помощью ImageJ и представлена ​​в виде гистограмм над пятнами. Блот представляет три независимых эксперимента. e Динамика индуцированного рапамицином взаимодействия FRB/FKBP. Клетки HEK 293, экспрессирующие FRB-IN и IC-FKBP1A, обрабатывали рапамицином (100 нМ) в течение различных периодов времени, как указано, с последующим вестерн-блоттингом. Плотность сплайсированных полос (FRB-FKBP1A) была количественно определена с помощью ImageJ и представлена ​​в виде гистограмм над пятнами. Блот представляет пять независимых экспериментов. f Стабильные клетки, полученные из HEK 293 T-Rex FlpIn с FRB-IN и IC-FKBP1A , вставленными в участок FRT, обрабатывали указанными различными концентрациями тетрациклина в течение 16 часов с последующей обработкой рапамицином (100 нМ) в течение 2 часов, а затем анализ методом вестерн-блоттинга. Клетки HEK 293, временно трансфицированные FRB-IN и IC-FKBP1A, использовали в качестве контроля (две правые дорожки). Блот представляет три независимых эксперимента. Исходные данные доступны в  ^{Файл исходных данных} .

Расщепленный интеин GP41-1, который был идентифицирован по данным метагеномной последовательности окружающей среды ⁹ , был выбран для использования в системе SIMPL из-за его небольшого размера (88 аминокислот в IN и 37 аминокислот в IC). ) и потому, что он обладает самой быстрой скоростью реакции среди всех исследованных сплит-интеинов ^{7 , 10 , 11} . Индуцированная рапамицином гетеродимеризация FKBP1A (слитого IC) и рапамицин-связывающего (FRB) домена FKBP mTOR ¹² (слитый IN) использовали в качестве тестового примера для оценки эффективности SIMPL на фоне клеток млекопитающих HEK 293. Основным препятствием для реализации SIMPL является внутренняя близость между IN и IC, которая вводит сплайсинг, не связанный с взаимодействием приманки/жертвы. Поэтому мы переработали сплит-интеин GP41-1. GP41-1 повторно разделили на восьми разных участках (рис. ) и оценили их поведение (рис. ). Интеин расщеплен в положении C25 (нумерация от последней C-концевой аминокислоты IC, дополнительная рис. 9).0015 2a ) продемонстрировал наилучшую эффективность без очевидной потери ферментативной активности и минимальной самоассоциации, которая едва обнаруживается вестерн-блоттингом. Реакция сплайсинга C25 происходила с высокой точностью, поскольку обнаруживались только родительские и сплайсированные белки (рис. ). Это говорит о том, что N- или C-концевого расщепления не произошло, что является обычной побочной реакцией многих расщепленных интеинов ^{6 , 13} . Идентичность сплайсированного белка дополнительно подтверждали с помощью иммунопреципитации, при которой белки поглощали антителом α-FLAG, строго промывали и исследовали антителом α-V5 (или наоборот). В обоих случаях был обнаружен только белок сплайсинга, и в образце без обработки рапамицином не наблюдалось явного сигнала (дополнительная рис. 9).0015 2б ). Поэтому сплит-интеин C25 GP41-1 был принят для использования в нашей системе SIMPL. Следует отметить, что экспрессия FRB, слитого с WT IN, FRB-IN (C37), почти не выявлялась вестерн-блоттингом, возможно, вследствие быстрой деградации из-за его сильно разупорядоченной конформации. Кроме того, в образце WT (C37) появились дополнительные полосы, указывающие на побочные продукты расщепления. Оба вредных эффекта были значительно уменьшены или устранены при использовании всех повторно расщепленных интеинов, что свидетельствует об улучшении производительности, достигнутом за счет повторного расщепления.

Чтобы охарактеризовать систему SIMPL, мы обработали клетки HEK 293, временно трансфицированные конструкциями FRB/FKBP1A SIMPL, с различными концентрациями рапамицина (рис. ). Результаты показали типичную зависимость доза-реакция с диапазоном доз, аналогичным тем, которые были измерены методами на основе BRET ¹⁴ . Эксперимент с временным курсом лечения рапамицином также продемонстрировал быстрый ответ, при этом взаимодействие наблюдалось всего за 2 минуты (наименьший используемый интервал наблюдения) и постоянно накапливалось с течением времени (рис. ). Подобная кинетика также наблюдалась в клетках HeLa (дополнительная рис. 9).0015 2c ) и клетки аденокарциномы легкого PC9 (дополнительный рисунок ^2d ), что позволяет предположить, что SIMPL можно применять к различным клеточным линиям млекопитающих. Следует отметить, что этот профиль сигнала временного ряда отличается от профиля, наблюдаемого с помощью других методов: в экспериментах, проведенных с использованием NanoBRET, наблюдалось быстрое достижение равновесия между ассоциацией и диссоциацией ¹⁴ . Это происходит из-за различий в том, что измеряют различные методы. Такие методы, как NanoBRET, обычно сами обнаруживают комплексы PPI. Напротив, SIMPL измеряет только событие ассоциации белка, но не его диссоциацию или устойчивый комплекс.

Мы дополнительно оценили SIMPL в изогенных стабильных клетках, чтобы изучить потенциальные проблемы, возникающие в результате транзиторной трансфекции, такие как неравномерная экспрессия в различных клетках и трудности с управлением уровнем экспрессии. Стабильная клеточная линия была создана путем включения как FRB-IN , так и IC-FKBP1A в геном клеток хозяина Flp-In T-Rex HEK 293 посредством интеграции, опосредованной рекомбиназой Flp. Клетки с разными уровнями экспрессии как FRB, так и FKBP1A, индуцированными инкубацией с различными дозами тетрациклина, обрабатывали рапамицином (рис.  ). Индуцированный взаимодействием сплайсинг и дозозависимая экспрессия FRB и FKBP1A наблюдались во всех образцах, даже при самой низкой дозе тетрациклина (30 нг/мл). Важно отметить, что увеличение экспрессии белка не сопровождалось значительным увеличением фонового сигнала, судя по образцам без обработки рапамицином. Эти наблюдения показывают, что реакция SIMPL эффективна, специфична и высокочувствительна и может правильно работать в широком диапазоне уровней экспрессии приманки и жертвы.

Альтернативные форматы SIMPL для расширения возможностей обнаружения

В приведенном выше прототипе SIMPL молекула-приманка слита на своем С-конце с фрагментом IN (формат IN, или наживка-V5-IN), а жертва слита на его N-конец к фрагменту IC (формат IC или IC-FLAG-prey). Несмотря на свою функциональность во многих случаях, такое расположение ограничивает общие возможности обнаружения SIMPL, поскольку в некоторых случаях два тега в этом формате могут быть пространственно недоступны друг другу. Кроме того, функция некоторых белков может быть нарушена присутствием меток на специфических концах, что требует другой стратегии. Таким образом, мы разработали два альтернативных варианта конструкции интейнов (рис.  ). В формате C-конца IC (CIC или prey-IC-FLAG) IC сливается с C-концом объекта-жертвы, сохраняя при этом тег FLAG ниже по течению. Его взаимодействие с приманкой IN приводит к сплайсингу между приманкой (а также меткой V5) и меткой FLAG, в результате чего образуется пептид bait-V5-FLAG. Точно так же формат NIN (V5-IN-bait) помечает приманку на N-конце фрагментом IN и расположенным выше пептидом V5. Его взаимодействие с жертвой IC приводит к образованию пептида V5-FLAG-жертвы. Поскольку оба подхода приводят к переносу метки, они по-прежнему обеспечивают считывание взаимодействия, совместимое с вестерн-блоттингом или вестерн-блоттингом, связанным с IP. Однако взаимодействие между приманкой NIN и добычей CIC приведет к образованию сплайсированного небольшого пептида V5-FLAG, который невозможно обнаружить с помощью вестерн-блоттинга. Чтобы решить эту проблему, мы создали конструкцию CIC-GFP (prey-IC-FLAG-GFP), которая может реагировать с приманкой NIN с образованием пептида V5-FLAG-GFP, который позволяет обнаруживать его с помощью вестерн-блоттинга или других анализов. Оценка всех четырех комбинаций различных структур SIMPL с использованием пары FRB/FKBP1A подтвердила их осуществимость, при этом индуцированные рапамицином полосы, соответствующие молекулярной массе надлежащим образом сплайсированного белка, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга во всех случаях (рис., дополнительная таблица 9).0015 1 ). Следует отметить, что в образце комбинации NIN/CIC-GFP без обработки рапамицином появлялся базальный сигнал сплайсинга. Это может происходить из-за изменения аффинности, вызванного различным мечением или высоким уровнем экспрессии белков. Однако соответствующий образец, обработанный рапамицином, демонстрирует резко повышенный сигнал (более чем в восемь раз по плотности), благодаря чему состояния легко отличить друг от друга при использовании надлежащих контролей и количественного определения. Таким образом, все четыре комбинации подходят для использования при обнаружении PPI в SIMPL.

Открыть в отдельном окне

Разработка альтернативных форматов SIMPL для расширения его возможностей.

a Форматы IN/IC позволяют соединять наживку и добычу. В ориентации CIC IC-FLAG слит с С-концом белка-жертвы (Prey-IC-FLAG). Его комбинация с приманкой IN (Bait-V5-IN) приводит к передаче тега FLAG на приманку, генерирующую Bait-V5-FLAG. В ориентации NIN V5-IN сливается с N-концом приманки (V5-IN-Bait). Его использование с жертвой IC (IC-FLAG-Prey) вызывает передачу тега V5 жертве, таким образом, создавая V5-FLAG-Prey. Конструкция CIC-GFP (Prey-IC-FLAG-GFP) предназначена для обнаружения комбинации NIN/CIC-GFP, которая продуцирует пептид V5-FLAG-GFP. b Эффективность различных форматов SIMPL была экспериментально оценена с использованием рапамицин-индуцированного взаимодействия FRB/FKBP1A, при котором соответствующие конструкции приманки и жертвы были временно трансфицированы. Полосы продуктов сплайсинга выделены треугольниками, а исходные белки выделены звездочками. Плотность сплайсированных полос (FRB-FKBP1A) была количественно определена с помощью ImageJ и представлена ​​в виде гистограмм над пятнами. Блот представляет три независимых эксперимента. Исходные данные доступны в  ^{Файл исходных данных} .

Платформа твердофазного иммуноферментного анализа для анализа SIMPL и его беспристрастная оценка

Хотя использование SIMPL с вестерн-блоттингом применимо для детального анализа PPI, оно ограничено анализами с низкой пропускной способностью и не поддается точному количественному определению. Поэтому мы разработали альтернативную платформу SIMPL, связанную с иммуноферментным анализом (ELISA), для высокопроизводительного количественного измерения ИПП. Для этого в конструкцию приманки в тандеме с V5 вводили гемагглютининовую (HA) метку. Это позволяет отслеживать сплайсинг белка с использованием формата ELISA, при этом захват белка выполняется с использованием антитела α-FLAG, а обнаружение выполняется с использованием антитела α-HA, связанного с пероксидазой хрена (HRP) (рис.  ). Сигнал SIMPL можно нормализовать по экспрессии приманки, которую можно аналогичным образом измерить с помощью ELISA с использованием иммобилизации с антителом α-V5 с последующей детекцией с помощью конъюгированного с HRP антитела α-HA (рис. ). Эффективность платформы ELISA проверяли путем мониторинга дозозависимого взаимодействия FRB/FKBP1A, индуцированного рапамицином, во всех четырех комбинациях: IN/IC, IN/CIC, NIN/IC и NIN/CIC-GFP (рис. ). Результаты всех четырех комбинаций показали ожидаемую зависимость доза-реакция, согласующуюся с вестерн-анализом (рис. ), демонстрируя осуществимость SIMPL ELISA. В частности, профили IN / IC, полученные как с помощью анализа ELISA, так и с помощью количественного вестерн-анализа (рис. ), показали заметное сходство. Хотя две комбинации, NIN/IC и NIN/CIC-GFP, показали относительно повышенные базальные уровни сплайсинга, эти фоновые сигналы были недостаточно высокими, чтобы мешать интерпретации сигнала сплайсинга, индуцированного рапамицином, с устойчивым 1,5- и 4-кратным увеличением. наблюдались в форматах NIN/IC и NIN/CIC-GFP в анализе ELISA, соответственно, после лечения рапамицином. Кроме того, экспрессия только приманки, либо FRB (IN), либо FRB (NIN), не показала никакого ответа на обработку рапамицином, что еще раз демонстрирует специфичность анализа.

Открыть в отдельном окне

Настройка платформы SIMPL ELISA и ее оценка с эталонными ИПП.

a В конструкцию приманки вводится дополнительная метка HA. Сплайсированные белки захватываются иммобилизованным антителом α-FLAG и измеряются с помощью антитела α-HA, конъюгированного с HRP. Все четыре формата SIMPL, описанные на рис., совместимы с ELISA. b Белки-приманки можно измерить аналогичным образом с помощью ELISA с использованием иммобилизованного антитела α-V5 и зонда антитела α-HA, конъюгированного с HRP. c Платформу ELISA оценивали по индуцированному рапамицином взаимодействию FRB/FKBP1A. Клетки HEK 293, экспрессирующие FRB и FKBP1A в различных форматах, обрабатывали различными дозами рапамицина, как указано, в течение 30 минут с последующим лизисом и анализом ELISA. Эксперимент был выполнен с четырьмя техническими повторами, и каждый повтор представлен в виде одной точки. d Сравнительный анализ общей производительности платформы SIMPL ELISA. В качестве положительного эталонного набора (PRS) были выбраны 88 ИПП, хорошо описанных в литературе. Из приманки и жертв PRS было выбрано 88 пар комбинаций приманка/жертва с наименьшей возможностью взаимодействия, чтобы сформировать случайный эталонный набор (RRS). Затем оба набора подвергали скринингу с использованием анализа SIMPL ELISA в форматах IN/IC и IN/CIC. Сигнал сплайсинга был нормализован по экспрессии приманки. Анализ рабочих характеристик приемника (ROC) был выполнен, как представлено. Представленные здесь данные являются репрезентативным результатом трех экспериментов. e Характеристики анализа SIMPL с точки зрения чувствительности (истинно-положительные результаты) и ложноположительных результатов (1-специфичность). Пороговые значения для положительного обнаружения были определены из ROC-анализа, как в d . Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов, показывающие среднюю скорость восстановления ± SEM. f Сравнение SIMPL-обнаружения отдельных ИПП в PRS с результатами семи различных методов ИПП, полученными из литературы ^{16 – 18} . Исходные данные доступны в файле исходных данных .

Затем мы оценили систему SIMPL, используя подход сравнительного анализа с несмещенными эталонными наборами PPI, который широко используется для оценки общей производительности метода PPI. Мы использовали положительный эталонный набор (PRS), который содержал 88 доступных положительных PPI, полученных из ранее хорошо зарекомендовавшего себя PRS человека (hPRS) ¹⁵ , включая различные типы PPI и охватывающие те, которые встречаются в различных субклеточных местах (дополнительная таблица 9). 0015 2 ). Наш случайный эталонный набор (RRS) содержал 88 пар белков с приманками и жертвами, выбранными из PRS, но использованными в комбинациях, которые, как определено вычислительным путем, имеют низкую вероятность взаимодействия (дополнительная таблица ² ). Эталонные наборы оценивались с помощью платформы ELISA в двух форматах: приманка (IN)/добыча (IC) и приманка (IN)/добыча (CIC) (дополнительная таблица ³ ). Экспрессия приманок в тех же образцах также была протестирована с помощью ELISA (дополнительный рисунок ^3a ), и таким образом каждый сигнал SIMPL был нормализован к соответствующему выражению приманки (дополнительный рисунок ^3b ). Анализ рабочих характеристик приемника (ROC) анализов продемонстрировал исключительную чувствительность со значениями AUC 0,806 и 0,867 для форматов IN/IC и IN/CIC соответственно (рис. ). Соответственно, 41% (IN/IC) или 56% (IN/CIC) ИПП могут быть обнаружены с помощью SIMPL без ущерба для специфичности анализа и поддержания уровня ложноположительных результатов на уровне ~5% (рис.  ), определяемого с пороговыми значениями, полученными из РПЦ анализирует. Далее мы сравнили показания ELISA с вестерн-блоттингом, выбрав 10 ИПП с высокими сигналами ELISA (выше порога) и 10 с низкими сигналами ELISA (ниже порога) либо в формате IN/IC, либо в формате IN/CIC, и повторно протестировали их с помощью вестерн-блоттинга. (Дополнительный рис. ^{3с, д} ). Результаты были очень согласованными между двумя методами; девять PPI в группе с высоким IC и все PPI в группе с высоким CIC представляли собой четко наблюдаемые полосы сплайсинга. Напротив, только один PPI в каждой группе с низким уровнем сигнала представлял сильный сигнал сплайсинга по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в полосах с высоким уровнем сигнала. Сравнение с результатами других методов PPI в литературе ^{16 – 18} показывает улучшение обнаружения, продемонстрированное с более широким охватом (рис. ). Интересно, что многие PPI могут быть обнаружены SIMPL с использованием форматов IN/IC и IN/CIC. Тем не менее, существуют различия между двумя ориентациями, предположительно из-за пространственной геометрии взаимодействующих молекул или из-за нарушения функций меченых концов. В целом, формат CIC демонстрирует лучшую производительность в описанных здесь тестах (рис. , дополнительный рис. 9).0015 3e ). Например, белки-жертвы, содержащие сигнальные пептиды, показали лучшую обнаруживаемость в формате CIC (дополнительный рисунок ^3e ), поскольку маркировка N-концов блокирует их распознавание частицей распознавания сигнала и тем самым влияет на их правильную сортировку на мембране.

Дальнейшая характеристика SIMPL с физиологическими ИПП

Затем мы использовали SIMPL для исследования физиологических ИПП и выбрали ИПП по оси EGFR-RAS-ERK1/2, важному сигнальному пути ¹⁹ . Активированный EGFR подвергается аутофосфорилированию и рекрутирует каркасные белки, такие как SHC1, для передачи сигнала нижестоящим механизмам ²⁰ . На уровне RAS активированная RAS (KRAS в этом исследовании) связывает и напрямую активирует киназы RAF ²¹ (RAF1 в этом исследовании). Когда EGFR-IN и IC-SHC1 коэкспрессировались в клетках HEK 293, их взаимодействие было зафиксировано в виде полосы сплайсинга над EGFR, распознаваемой как антителами α-FLAG, так и антителами α-V5 (рис. ). Взаимодействие также было эффективно обнаружено с использованием конструкции SHC1-CIC (дополнительная рис. 9).0015 4а ). Взаимодействие зависит от активности EGFR, так как конститутивно активный мутант EGFR (L858R) усиливал сигнал, в то время как мертвый мутант киназы (D855A) ^{22 , 23} устранял взаимодействие (рис. ). Для обнаружения взаимодействия KRAS/RAF1 мы выбрали конструкцию IC-KRAS, чтобы избежать нарушения липидирования ее С-конца. Анализ с RAF1-IN выявил специфическое взаимодействие (рис. ), поскольку KRAS дикого типа и его конститутивно активные мутанты (G12D и Q61H) демонстрировали сигналы сплайсинга, в то время как с доминантно-отрицательным мутантом KRAS (S17N) явного сигнала не наблюдалось ²⁴ . Анализ с конструкцией NIN-RAF1 показал более выраженный сигнал сплайсинга, чем RAF1-IN (более чем в шесть раз по плотности, дополнительная фигура ^4b ). Следует отметить, что домен, ответственный за связывание RAS, расположен на N-конце RAF1, и, следовательно, N-конец физически ближе к RAS. Поэтому мы предполагаем, что усиление сигнала вызвано мечением N-конца RAF1, что улучшает доступность реактивных концов. Таким образом, эти два классических PPI, участвующих в нормальной и онкогенной передаче сигналов, были успешно воспроизведены с помощью SIMPL.

Открыть в отдельном окне

Выявление физиологических ИПП и их ингибирование с помощью SIMPL.

a Взаимодействие EGFR/SHC1. EGFR WT, неактивные (D855A) или конститутивно активные (L858R) мутанты в формате IN коэкспрессировались с SHC1 (IC) в клетках HEK 293. Их взаимодействие было проанализировано с помощью западного анализа. б Взаимодействие КРАС/РАФ. RAF1-IN и IC-KRAS (WT, неактивный мутант S17N или активный мутант G12D или Q61H) временно экспрессировались в HEK 29.3 клетки с последующим вестерн-анализом. c Стабильные клетки, полученные из HEK 293 T-Rex FlpIn с EGFR (IN) и SHC1 (IC) , вставленными в участок FRT, обрабатывали указанными различными концентрациями тетрациклина в течение 6 часов с последующей обработкой EGF (100 нг/мл) в течение 2 мин, а затем анализ методом вестерн-блоттинга. с.э. короткая выдержка, т.е. длительное воздействие. Каждый блот в a – c представляет три независимых эксперимента. д SIMPL-анализ взаимодействия киназы/субстрата. Указанные конструкции киназа-IN индивидуально экспрессировались вместе с их субстратами либо в формате IC, либо в формате CIC, и их взаимодействия определяли с помощью анализа ELISA. LSM2 использовали в качестве жертвы отрицательного контроля. e Митохондриальные ИПП. Выбранные митохондриальные белки-приманки были сконструированы в формате IN. Затем их совместно экспрессировали с указанными жертвами либо в формате IC, либо в формате CIC, либо в обоих форматах. Взаимодействия исследовали с помощью ELISA. LSM2 использовали в качестве жертвы отрицательного контроля. наружная митохондриальная мембрана ОММ, межмембранное пространство ИМС, внутренняя митохондриальная мембрана ИММ. f Повторное тестирование взаимодействия PDHA1/PDHB с SIMPL, связанной с ELISA. В одном образце (четвертый слева) митохондриальная последовательность PDHA1 была заменена последовательностью ядерной локализации. В последнем образце (первый справа) PDHA1 дикого типа и PDHB экспрессировали в отдельных клетках, а клеточные лизаты смешивали для ELISA. Эксперименты в d – f проводились в трех повторностях, и их средние значения представлены в виде столбцов, где каждая повторность показана одной точкой. Исходные данные доступны в  ^{Файл исходных данных} .

Поскольку исследование взаимодействия FRB/FKBP1A, индуцированного рапамицином, продемонстрировало способность SIMPL отслеживать кинетику взаимодействия (рис.  , дополнительная рис.  ^{2c, d} ), мы проверили, может ли SIMPL также отслеживать кинетику физиологических ИПП на примере рекрутирования EGF-активированного SHC1 в EGFR. Мы обнаружили, что взаимодействие (сплайсинг) между EGFR (IN) и SHC1 (IC) уже происходило без обработки EGF, когда они были временно сверхэкспрессированы в клетках (рис. ), и сигнал был лишь немного усилен после стимуляции EGF (дополнительная рис. ^4c ), поскольку соотношение плотности сплайсированных полос между необработанными и стимулированными EGF (5 мин) образцами составляет 1:1,7. Следует отметить, что сверхэкспрессия EGFR вызывает лиганд-независимую аутоактивацию и последующее привлечение SHC1 (ref. ²⁵ ). В отличие от фосфорилирования и PPI, сплайсинг необратим и, следовательно, приводит к накоплению сплайсированного белка. Этот накопленный сплайсированный белок, вероятно, маскировал сигнал, индуцированный стимуляцией EGF. Ключом к преодолению этого является снижение уровня и продолжительности выражения приманки и добычи. Таким образом, мы создали стабильную клеточную линию, полученную из Flp-In T-REx HEK 29.3 путем включения как EGFR (IN) , так и SHC1 (IC) в геном посредством интеграции, опосредованной рекомбиназой Flp. Это позволило контролировать амплитуду и временную индукцию их экспрессии тетрациклином. Примечательно, что в клетках, обработанных тетрациклином в течение 6 часов в условиях голодания (0,1% фетальной телячьей сыворотки), сигнал сплайсинга взаимодействия EGFR/SHC1 был заметно снижен, но восстанавливался при стимуляции EGF в течение 2 минут (рис. ), что подтверждает целесообразность использования SIMPL для соблюдения физиологических ИПП. Следует отметить, что из-за утечки репрессорной системы тетрациклина в клетках без обработки тетрациклином наблюдались низкие уровни EGFR (IN) и SHC1 (IC). В этих условиях также наблюдался EGF-стимулированный сплайсинг, что согласуется с высокой чувствительностью анализа SIMPL.

Поскольку большинство методов PPI плохо подходят для обнаружения слабых или временных PPI, мы хотели проверить, способна ли SIMPL отслеживать эти типы взаимодействий. Мы выбрали протеинкиназы в качестве нашего теста, поскольку их ассоциация с субстратами, подобно обычным взаимодействиям фермент/субстрат, обычно характеризуется как преходящая и слабая ²⁶ . Таким образом, IN-слитые MAPK1 (ERK2), MAPK8 (JNK1), MAPK14 (p38α MAPK), MAPK7 (ERK5), AKT1 и PRKCA (PKCα) были исследованы с несколькими хорошо задокументированными субстратами как в форматах IC, так и в CIC. Анализ ELISA показал, что более 50% этих ИПП могут быть обнаружены с помощью SIMPL в одном или обоих форматах (рис. ). Члены MAPK продемонстрировали относительно сильные взаимодействия, которые могут быть усилены путем стыковки за пределами их активных сайтов ²⁷ . Мы исследовали, может ли SIMPL зафиксировать кинетический процесс взаимодействия киназы/субстрата. Действительно, мы наблюдали усиленное взаимодействие MAPK1/ELK1 после активации MAPK1, вызванной стимуляцией тетрадеканоилфорболацетатом (ТРА) (дополнительный рисунок ^4d ). Однако во многих случаях активации киназы явного увеличения не наблюдалось (дополнительная рис. ^{4e – g} ). Мы предполагаем, что в этих случаях накопление сплайсированных белков из исходного состояния могло маскировать реакцию на стимуляцию из-за необратимости реакции сплайсинга, и этого можно было бы избежать, уменьшив базальную экспрессию приманки/жертвы с помощью подхода со стабильной клеточной линией. упомянутое выше для EGFR/SHC1, области, которая заслуживает дальнейшего изучения.

Оценка с эталонным набором PPI предполагает, что SIMPL способна обнаруживать PPI в различных клеточных компартментах, поскольку PRS охватывает PPI, встречающиеся в разных местах, таких как ядро, цитоплазма, плазматическая мембрана и внеклеточное пространство (дополнительная таблица ² ). Мы дополнительно проверили это, изучив митохондриальные PPI с помощью SIMPL, поскольку митохондрии представляют собой особые органеллы с различными характеристиками, и их PPI часто трудно изучать. Для этой цели мы выбрали несколько хорошо изученных митохондриальных ИПП (дополнительная таблица 9).0015 4 ), включая белки, участвующие в окислительном фосфорилировании ²⁸ , транспорт ²⁹ , организация Cristea ³⁰ и метаболизм ³¹ . Приманки были приготовлены с использованием формата IN, чтобы избежать интерференции транзитных пептидов, обычно на N-концах митохондриальных белков. Соответствующие жертвы были сконструированы либо в конфигурации IC, либо в CIC (или в обеих), чтобы уменьшить вероятность стерической интерференции, предотвращающей их ассоциацию с IN, или для предотвращения неправильной сортировки белков-жертв. Из 10 исследованных ИПП 8 (TIMM50/TIMM23, PDHA1/PDHB, CHCHD6/CHCHD3, NDUFV1/NDUFV3, SDHA/SDHB, UQCRC2/UQCRC2, ATP5MC1/ATP5MC1 и ETFA/ETFB) были успешно обнаружены (рис. ), в том числе белки, локализованные в различных субмитохондриальных компартментах (матрикс, внутренняя мембрана и межмембранное пространство). Мы протестировали два дополнительных контроля на взаимодействие PDHA1/PDHB, чтобы исключить возможность сплайсинга в клеточных лизатах во время обработки образцов (рис. ). В первом контроле последовательность митохондриального нацеливания PDHA1 была заменена сигналом ядерной локализации MYC. Эта модификация предотвращает сортировку полученного NLS-PDHA1 в митохондрии и, соответственно, его взаимодействие с PDHB не наблюдалось. Во втором контроле PDHA1 и PDHB были отдельно экспрессированы в разных клетках, и два клеточных лизата были смешаны и проанализированы с помощью ELISA. И снова взаимодействия между PDHA1 и PDHB обнаружено не было. Вместе эти результаты показывают, что значительный объем сплайсинга SIMPL PDHA1/PDHB не происходит, если оба белка не нацелены должным образом на митохондрии, что подтверждает широкую применимость SIMPL для мониторинга взаимодействий с различными субклеточными локализациями.

Обнаружение ИПП у

C. elegans с помощью SIMPL

Затем мы исследовали возможность использования системы SIMPL у многоклеточных животных, используя нематоды Caenorhabditis elegans в качестве модели. Мы выбрали PRS C. elegans из 27 пар PPI из ранее выявленных в литературе подтвержденных взаимодействий ³² и из взаимодействий, использованных ранее для оценки подходов к картированию бинарных PPI ³³ (дополнительная таблица 9).0015 5 ). Мы также собрали C. elegans RRS путем случайного комбинирования пар белков из PRS, исключая известные интеракторы. Полноразмерные ORF соответствующих генов амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в векторы, содержащие метки расщепленного интеина, оптимизированные для экспрессии в C. elegans , но в остальном идентичные фрагментам сплит-интеина, совместимым с ELISA, использованным выше.

Белки экспрессировались под контролем общего рибосомного промотора rps-0 . Трансгенных животных генерировали с помощью микроинъекции, и для каждого белка-жертвы вводили конфигурации как IC, так и CIC. Чтобы обеспечить точную количественную оценку сплайсинга с помощью ELISA, мы вводили в 4 раза более высокую концентрацию плазмиды-жертвы, чем плазмиды-приманки, чтобы гарантировать, что сплайсинг белка-приманки не ограничен доступностью белка-жертвы. Все трансгенные линии сначала тестировали на экспрессию белка-приманки и белка-жертвы с помощью вестерн-блоттинга. В целом, мы восстановили 10 линий, экспрессирующих пары PRS, и 13 линий, экспрессирующих пары RRS, представляющих 7 и 9.уникальные пары белков соответственно (рис. ). Сначала мы проанализировали каждую строку на предмет сплайсинга с помощью вестерн-блоттинга (дополнительный рисунок ⁵ ). Мы наблюдали видимый сплайсинг для 7/10 пар PRS и 5/13 пар RRS; однако уровни сплайсинга для пар RRS были ниже, чем для пар PRS. Затем мы количественно определили уровни сплайсинга с помощью ELISA, как указано выше, анализируя два независимых белковых лизата для каждой трансгенной линии. Используя скользящий пороговый уровень сигнала сплайсированной приманки/общей приманки для определения положительных взаимодействий, мы наблюдали четкое разделение между парами белков PRS и RRS в обоих повторах (рис. ). При уровне отсечки, который оптимизирует долю истинно положительных результатов по сравнению с ложноположительными результатами, обнаруженными в обоих повторах, 8/10 пар PRS дали положительный результат в обоих повторах, а оставшиеся 2 пары дали положительный результат в одном повторе (рис.  ). Напротив, ни одна из пар RRS не дала положительный результат в обоих повторах, хотя шесть пар дали положительный результат в одном повторе. Коллапс ориентации IC/CIC, 7/7 пар белков PRS дали положительный результат и 1/9Пары RRS дали положительный результат. В целом, эти результаты показывают, что система SIMPL работает в C. elegans , и предполагают, что ее универсальный характер может позволить использовать ее во многих других системах.

Открыть в отдельном окне

Обнаружение PPI в C. elegans с SIMPL.

a Схема создания и тестирования трансгенных линий C. elegans для использования с анализом SIMPL ELISA. Первоначально было успешно клонировано 15 пар PPI с положительным эталонным набором (PRS) и введено в C. elegans вместе с 21 случайной (RRS) парой PPI как в конфигурациях IN/IC, так и IN/CIC (всего введено 72 строки). Потенциальные трансгенные линии были проверены с помощью вестерн-блоттинга на предмет экспрессии как приманки, так и конструкции-жертвы, в результате чего было получено 10 полных линий PRS и 13 полных линий RRS (IC + CIC), представляющих 7 и 9 различных пар PPI, соответственно. b Результаты анализа SIMPL ELISA в двух биологических повторностях с долей пар PPI, которые являются положительными при различных пороговых значениях. Пороги были установлены как отношение сплайсированного сигнала к общему сигналу. Биологический повтор представлялся как среднее значение двух технических повторов. c Визуализация результатов SIMPL ELISA для индивидуально протестированных ИПП. Пороговое значение, используемое для определения того, был ли данный ИПП положительным или отрицательным, составляло 0,50 (стрелка в b ), что максимизировало количество истинно положительных и истинно отрицательных взаимодействий между обоими биологическими повторами. Пары, принадлежащие RRS, никогда не были положительными в обоих повторах по сравнению с PRS. Исходные данные доступны в файле исходных данных .

SIMPL как платформа для скрининга наркотиков

Наконец, мы исследовали, может ли SIMPL служить в качестве инструмента скрининга наркотиков, в частности, в качестве анализа, который может обнаруживать ферментативные ингибиторы, а также ингибиторы ИПП. Поскольку сплайсинг белков является необратимым процессом, перед экспрессией приманки/жертвы необходимо вводить ингибиторы (рис. ). Используя в качестве примера взаимодействие EGFR/Shc1, мы наблюдали снижение сигнала SIMPL при введении AG1478 (ссылка ³⁴ ), ингибитора тирозинкиназы EGFR (TKI), который подавляет аутофосфорилирование EGFR и тем самым снижает EGFR/Shc1. взаимодействие (рис. ). В этом случае взаимодействие между Shc1 и EGFR происходит после активации EGFR и служит косвенным показателем активности EGFR. Затем мы проверили, может ли SIMPL также контролировать ингибирование ИПП, вызванное прямым ингибитором ИПП, с использованием венетоклакса, одобренного FDA препарата, нацеленного на взаимодействие BAX/BCL2 9.0015 ³⁵ , например. Сначала мы исследовали взаимодействие BAX/BCL2 (и контроля BAX/BCL2L1) в трех форматах SIMPL: IN/IC, IN/CIC и NIN/IC (рис. ). Обратите внимание, что для комбинации NIN-BAX/IC-BCL2 была проведена иммунопреципитация, чтобы отделить сплайсированный белковый продукт от родительского продукта аналогичного размера (рис.  ). Основываясь на этих результатах, пара NIN-IC показала самый высокий сигнал (рис. ). Используя эту комбинацию в SIMPL с показаниями ELISA, мы наблюдали сильное ингибирование взаимодействия BAX/BCL2 в присутствии венетоклакса с IC ₅₀ 9,1 нМ (очень похоже на результаты других клеточных анализов ³⁶ ), но не несвязанный контрольный TKI осимертиниб (рис. , красный и синий). Эффект венетоклакса на BCL2L1 (BCL-XL) был гораздо менее сильным, поскольку ингибирование ИПП BAX/BCL2L1 наблюдалось только при высокой концентрации венетоклакса (рис. , зеленый), что согласуется с предыдущими отчетами ³⁶ . В целом, эти результаты ясно демонстрируют потенциал использования SIMPL в качестве высокочувствительного инструмента для скрининга малых молекул.

Открыть в отдельном окне

SIMPL для идентификации ферментов/ингибиторов ИПП.

a График изучения ингибиторов ферментов/ИПП с помощью SIMPL. Чтобы избежать сплайсинга до того, как может произойти ингибирование, ингибитор необходимо вводить до экспрессии белка. Поскольку экспрессия находится под контролем промотора Tet-on, тетрациклин добавляют к клеткам вместе с ингибитором за 6 ч до анализа. b Изучение ингибитора киназы EGFR с помощью SIMPL. Ингибитор киназы EGFR AG1478 в различных указанных дозах инкубировали с клетками, экспрессирующими EGFR-IN и IC-SHC1. Полоса сплайсинга EGFR-SHC1, наблюдаемая вестерн-блоттингом, уменьшалась с увеличением концентрации AG1478. Блот представляет три независимых эксперимента. c – e Взаимодействие BAX/BCL2 анализировали в различных форматах, как показал вестерн-анализ. В случае NIN-BAX/IC-BCL2 была проведена иммунопреципитация для отделения сплайсированного белка от его исходного белка, поскольку они обладают сходной подвижностью при электрофорезе ( и ). Каждый блот представляет три независимых эксперимента. f Тепловая карта показаний SIMPL ELISA взаимодействия BAX/BCL2 в различных форматах. Серый цвет: не тестировался. LSM3 и LSM2 использовали в качестве отрицательного контроля для приманки и добычи соответственно. г Исследование ингибитора ИПП BCL2/BAX венетоклакса с помощью SIMPL. Клетки, экспрессирующие NIN-BAX и IC-BCL2 (или BCL2L1 в качестве контроля), обрабатывали венетоклаксом (или осмеритинибом в качестве отрицательного контроля) в различных концентрациях, как указано. Затем клетки подвергали анализу ELISA. Сигналы SIMPL были нормированы на экспрессию приманки. Эксперимент проводили в трех повторностях, и каждая повторность представлена ​​в виде одной точки. Исходные данные доступны в файле ^{исходных данных} .

Не существует универсального метода, который работал бы для каждого ИПП, и все методы протеомики взаимодействия имеют свои предпочтения, что приводит к малому перекрытию охвата ИПП во многих подходах ^{3 , 37} . Мы разработали SIMPL для расширения зоны обнаружения. PRS, полученный из hsPRS-v1 (ссылка ¹⁵ ), используется для оценки пригодности SIMPL и беспристрастного сравнения его с семью различными тестами PPI: LuTHy ¹⁷ , LUMIER ³⁸ , MAPPIT ³⁹ , KISS ¹⁶ , Yeast Two-Hybrid (YTH) ⁴⁰ , PCA ⁴¹ , and wNAPPA ⁴² . Наши данные демонстрируют улучшение обнаружения PPI с точки зрения чувствительности, охвата и объективного параметра AUC. Далее мы протестировали SIMPL на C. elegans и получили аналогичные результаты. Таким образом, SIMPL является чувствительным методом обнаружения PPI с низким уровнем ложных срабатываний (≤5%) и пригодностью для использования в различных моделях in vivo.

Многие особенности сплит-интеинового датчика делают SIMPL уникальной системой. Поскольку интеины не существуют у млекопитающих, маловероятно, что они будут мешать функционированию клеток млекопитающих. Действительно, мы не наблюдали каких-либо клеточных изменений, когда интеины ортогонально экспрессируются в клетках млекопитающих. Небольшой размер расщепленного интеина GP41-1, используемого в SIMPL, также снижает его потенциал участия в неспецифических взаимодействиях. Кроме того, поскольку GP41-1 может работать в относительно широких физиологических условиях, он позволяет обнаруживать его в различных субклеточных местах. В отличие от многих методов PPI, в анализе SIMPL также не требуются дополнительные кофакторы.

Следует учитывать кинетические особенности расщепленных интеинов. Показано, что отделенный расщепленный интеин частично свернут или полностью неупорядочен. Распознавание между IN и IC инициирует процесс ассоциации, вызывает переход от беспорядка к порядку, а затем запускает сплайсинг ^{43 , 44} . Повторно расщепленный С25 GP41-1, разработанный в этом исследовании, предположительно протекает по аналогичному кинетическому пути, за исключением того, что ассоциация в основном обусловлена ​​​​взаимодействием приманки / жертвы, а не распознаванием между IN и IC из-за укорочения фрагмента IC. Действительно, большинство сенсорных фрагментов PPI на основе PCA находятся в развернутых конформациях до комплементации ⁴⁵ . В отличие от GP41-1, большинство из них, включая BiFC, следуют медленной кинетике комплементации, что ухудшает их способность обнаруживать быстрые взаимодействия. Физический механизм этой сверхбыстрой кинетики GP41-1 заслуживает полного изучения. Следует отметить, что PCA на основе люциферазы и некоторые другие методы PPI, такие как FRET, BRET ³ и недавно разработанный SPARK (инструмент для специфической белковой ассоциации, дающий считывание транскрипции с быстрой кинетикой) ⁴⁶ также способны отслеживать быстрые ИПП и, наряду с SIMPL, предоставляют надежный набор дополнительных инструментов для изучения этих ИПП и их кинетики in vivo.

Наиболее поразительной особенностью SIMPL является его необратимость. Комплементация многих сенсоров ФКА также необратима, но за счет энергетической ловушки. Ковалентный сплайсинг в SIMPL делает его полезным даже в суровых экспериментальных условиях, помогая избежать потери специфических взаимодействий (и усиления неспецифических взаимодействий) на этапах обработки, что является общей проблемой для многих методов, основанных на аффинности. Следует отметить, что необратимые сенсоры фактически регистрируют ассоциативное событие комплексообразования, а не сам комплекс. Накопление «неразрывного» сигнала также может существенно повысить чувствительность. Эта особенность вместе со сверхбыстрой активностью GP41-1 делает SIMPL хорошо подходящим для отслеживания кинетики PPI. Тем не менее, кинетические исследования с SIMPL должны быть тщательно спланированы, поскольку накопление базового сигнала взаимодействия может маскировать сигнал зарождающегося комплексообразования, если базовый ИПП относительно высок. В этом исследовании мы использовали индуцируемую экспрессию стабильно встроенных генов, чтобы помочь уменьшить базальный сигнал взаимодействия.

Наше исследование также демонстрирует применимость SIMPL в качестве платформы для характеристики ферментативных ингибиторов и ингибиторов PPI. Эффективность ингибитора, измеренная с помощью SIMPL, была очень близка к результатам, полученным с помощью других методов, что указывает на то, что SIMPL может служить привлекательным анализом на основе живых клеток для скрининга лекарств. Кроме того, SIMPL может помочь преодолеть проблемы, связанные с идентификацией соединений, которые специфически разрушают или усиливают действие ИПП, которые, хотя и являются многообещающими кандидатами для терапевтического вмешательства, на сегодняшний день трудно найти.

Примечательно, что расщепленные интеины ранее использовались для обнаружения PPI, хотя и в более сложном формате, в котором две части интеина соответственно слиты с компонентами расщепленных репортеров, таких как флуоресцентный белок или люцифераза ⁸ , и считывание производство функциональных сплайсированных репортерных молекул. Важно отметить, что расщепленные интеины, используемые в вышеупомянутом подходе, имеют тенденцию к самоассоциации ⁷ , процесс, который еще больше усугубляется аффинностью между половинками расщепленной репортерной молекулы, что может привести к значительному увеличению неспецифического ИПП. сигнал. По этим причинам метод не нашел широкого применения в исследованиях. Напротив, мы разработали прямую стратегию расщепления протеинов, которая позволяет связывать белки между приманкой и добычей или небольшими метками, сводя к минимуму введение дополнительных компонентов. Важно отметить, что мы также модернизировали наш датчик расщепленного интеина, чтобы преодолеть естественное сродство между компонентами интеина. Оба фактора резко снижают любое неспецифическое взаимодействие, связанное с системой обнаружения.

Как и любой другой метод PPI, SIMPL имеет определенные ограничения. Поскольку требуется гетерологичная экспрессия белков-приманок и белков-жертв, SIMPL не может измерять эндогенные PPI, если только метки не интегрированы в гены-мишени путем редактирования генов. Кроме того, SIMPL не может отслеживать диссоциацию белка из-за его необратимости. Однако, несмотря на эти ограничения, представленные здесь данные демонстрируют несколько привлекательных преимуществ SIMPL: повышенную высокую чувствительность без потери специфичности, широкую применимость к ИПП в различных клеточных компартментах или в разных типах клеток, способность обнаруживать слабые и транзиторные ИПП, потенциальное для отслеживания кинетики PPI, возможности количественного определения, совместимости с высокопроизводительным скринингом и отсутствия требований к специальному оборудованию или опыту. Поэтому мы предполагаем, что SIMPL найдет широкое применение в биомедицинских исследованиях, а также в фармацевтической промышленности.

Молекулярное клонирование и подготовка библиотеки

Плазмиды, содержащие кДНК расщепленного интеина GP41-1, pCAG-Co-InCreN и pCAG-Co-InCreC, были получены от Addgene. Векторы-приманки и жертвы SIMPL создаются путем интеграции фрагментов ДНК фрагментов расщепленного интеина GP41-1, линкеров и меток, а также кассеты для клонирования Gateway в основу вектора pCMV5 с помощью сборки Gibson (New England BioLabs). Плазмиды для стабильного клонирования FlpIn были созданы аналогичным образом в векторе pCDNA5/FRT/TO с приманкой и жертвой, включенными сборкой Гибсона. Большинство кДНК первоначально были получены из коллекции ORFeome человека или из коллекции Openfreezer в Исследовательском институте Луненфельда-Таненбаума 9.0015 ⁴⁷ . Те, которые не входят в состав векторов входного клона, были клонированы в pDONR223 с помощью реакций PCR и Gateway BP (Life Technologies). Затем различные фрагменты кДНК клонировали в векторы SIMPL с помощью реакций Gateway LR (Life Technologies). Сайт-направленный мутагенез создавали с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы KAPA HiFi (KAPA Biosystems). Плазмиды, созданные в этом исследовании, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Клеточные культуры и обработка

НЕК 293, клетки HEK 293 Flp-In T-Rex и HeLa выращивали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Life Technologies). Клетки PC9 выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для анализа ELISA клетки высевали в 96-луночные (Sarstedt AG & Co) или 384-луночные планшеты (Greiner Bio-One) по 15000 (96-луночные) или 5000 (384-луночные) клеток на лунку. Клетки трансфицировали различными плазмидами с полиэтиленимином (PEI) Max (Polysciences) ⁴⁸ . Выражение в HEK 293 Flp-In клетки T-Rex индуцировали обработкой клеток тетрациклином (1 мкг/мл) в течение 6–16 часов. Для экспериментов по изучению активации сигнального пути клетки голодали 0,1% фетальной телячьей сывороткой, а также обрабатывали тетрациклином в течение 6 часов перед стимуляцией EGF (Sigma-Aldrich), тетрадеканоилфорболацетатом (TPA) (Sigma-Aldrich) или анизомицином. (Сигма-Олдрич). Стабильные клеточные линии были созданы в соответствии с руководством Flp-In T-REx (Invitrogen). Вкратце, плазмиду, содержащую как приманку, так и ДНК жертвы, и плазмиду pOG44 (соотношение 1:10), котрансфицировали в HEK 29.3 клетки Flp-In T-Rex. Через 3 дня клетки подвергали пуромициновой селекции. Были отобраны отдельные колонии, и экспрессия приманки и добычи была подтверждена анализом вестерн-блоттинга.

Вестерн-блот-анализ и иммунопреципитация

Клетки лизировали в буфере Н (тритон Х-100 1%, β-глицерофосфат рН 7,3 50 мМ, ЭГТА 1,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, ортованадат 0,1 мМ, ингибитор ДТТазы 1 мМ с добавлением протеазы). (Рош)). После центрифугирования при 15 000 об/мин. в течение 10 мин супернатанты смешивали с буфером для образцов Лэммли, кипятили при 95 °C в течение 3–5 мин и подвергали вестерн-блот-анализу. Для иммунопреципитации супернатанты (0,3 мл) инкубировали с антителами при 4°С с вращением в течение 1 ч, после чего еще один час инкубировали с гранулами протеина G-сефарозы (GE Healthcare). Гранулы дважды промывали LiCl (0,5 M в Tris, pH 8,0, 0,1 мМ) и дважды буфером для лизиса, кипятили с буфером для образцов Лэммли, а затем подвергали вестерн-блоттингу. Для вестерн-блоттинга и иммунопреципитации использовали следующие антитела: антитело α-FLAG, приобретенное у Sigma-Aldrich Co. (F1804) в разведении 1:10000, и антитело α-V5 от Cell Signaling Technology (#13202) в разведении 1:10000. Каждое из вышеуказанных антител разводили в соответствии с протоколом поставщика.

ELISA

Клетки HEK 293 выращивали в 96-луночных или 384-луночных планшетах и ​​трансфицировали PEI, как указано выше. Клетки в каждой лунке лизировали в 120 мкл (96 лунок) или 80 мкл (384 лунки) буфера TNE (Tris pH 7,5 20 мМ, NaCl 150 мМ, ЭДТА 2 мМ и Triton X-100 0,5% с добавлением ингибиторов протеазы). Аликвоты лизатов (20 мкл) инкубировали в течение 3 часов при 4 °С в лунке 384-луночного планшета Lumitrac (Greiner Bio-One), покрытого антителом α-FLAG (20 мкл на лунку в разведении 1:100). и заблокирован с помощью BSA. После трехкратной тщательной промывки фосфатно-солевым буфером с добавлением 0,05% Tween 20 (PBST) планшет инкубировали с HRP-конъюгированным антителом α-HA (GeneTex GTX115044, разведение 1:5000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет трижды промывали PBST с последующим считыванием хемилюминесценции с использованием субстрата SuperSignal ELISA Pico (ThermoFisher).

Выбор пар RRS

Все пары наживка-жертва (75 наживок × 78 жертв) были рассмотрены для RRS, и было отобрано 88 пар, которые имели наименьшие шансы на взаимодействие, с использованием следующих критериев: (1) отсутствие в PRS ; (2) отсутствие в интегрированной базе данных взаимодействий вер. 2018-11 (ref. ⁴⁹ ), тем самым гарантируя, что пары не были обнаружены в экспериментальных исследованиях, предсказаны на основе ортологии или предсказаны пятью вычислительными алгоритмами; (3) самые низкие вероятности взаимодействия согласно алгоритму прогнозирования PPI FpClass ⁵⁰ ; и (4) максимальный охват потенциальных приманок и жертв.

C. elegans SIMPL-векторы и клонирование

Для облегчения сборки экспрессионных плазмид мы использовали стратегию клонирования на основе Sap I. Мы создали серию донорных векторов на основе устойчивого к канамицину клонирующего вектора pHSG298 (Takara Bio), в котором вставка фланкирована Sap I-сайтами. Расщепление с помощью Sap I дает выступающие части, которые обеспечивают сборку промотора, ORF, расщепленного интеина и UTR в целевой вектор (pMLS257 Addgene #73716) в одной реакции лигирования. Были созданы следующие плазмиды: (i) донорные плазмиды, содержащие IN (pJRK244), IC (pJRK036) и CIC (pJRK152) донорные последовательности расщепленного интеина. Аминокислотные последовательности сплит-интеина идентичны конструкциям сплит-интеина млекопитающих, совместимым с ELISA, но оптимизированы по кодонам для C. elegans и содержат искусственный интрон. (ii) две плазмиды донора промотора rps-0 , pJRK001 для сборки с IC и IN и pJRK151 для сборки с CIC. (iii) Три плазмиды unc-54 3′-UTR: pJRK150 для сборки с IC, pJRK153 для сборки с CIC и pJRK002 для сборки с IN. ORF амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК смешанной стадии и клонировали с тупыми концами в вектор pHSG298, расщепленный Eco53kI. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды, используемые для инъекций, очищали с использованием набора для очистки ДНК PureLink HQ Mini Plasmid DNA Purification Kit (ThermoFisher) с использованием стадии дополнительной промывки и буфера, рекомендованного для штаммов endA+.

Штамм C. elegans и условия культивирования

Штаммы C. elegans культивировали в стандартных условиях ⁵¹ . Использовались только гермафродиты, и все эксперименты проводились на животных, выращенных при 20 °C на чашках с агаровой средой для выращивания нематод, засеянных бактериями E. coli OP50.

Генерация внехромосомного штамма

Молодым взрослым животным N2 вводили 20 нг/мкл плазмиды IC/CIC SIMPL жертвы, 5 нг/мкл плазмиды IN SIMPL-приманки, 20 нг/мкл плазмиды, придающей доминантный фенотип Rol и устойчивость к гигромицину B (pDD382 Addgene #91830) и 55 нг/мкл лямбда-ДНК (ThermoScientific SM0191). Каждую пару белков вводили четырем гермафродитам и помещали на отдельные чашки. Через 2–3 дня в чашки добавляли гигромицин В (250 мкг/мл) для отбора трансгенных линий. Из каждого планшета отбирали одно животное F2 Rol для создания до четырех трансгенных штаммов на пару белков, и каждое тестировали на экспрессию конструкций SIMPL.

C. elegans Лизис и ИФА

Животных смешанной стадии, выращенных в условиях селекции Гигромицином В (250  мкг/мл), смывали М9буфер (0,22 М KH ₂ PO ₄ , 0,42 М Na ₂ HPO ₄ , 0,85 М NaCl, 0,001 М MgSO ₄ ) и дважды промывали буфером М. Затем образцы осаждали и ресуспендировали в 100–400 мкл лизирующего буфера (25 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Igepal 630 и 1 таблетка/50 мл полного коктейля ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich). ). После мгновенной заморозки в жидком азоте и оттаивания образцы обрабатывали ультразвуком с помощью Diagenode BioRupter Plus, 5 мин высокой настройки: 30 с вкл/30 с выкл на водяной бане при 4°C. Затем лизаты центрифугировали на максимальной скорости в настольной центрифуге при 4 °С в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса. ELISA проводили, как указано выше, но пикохемилюминесцентный субстрат SuperSignal ELISA использовали в неразбавленном виде (ThermoScientific).

Статистика

Двусторонний тест Стьюдента t с n  = 3 использовали для изучения значимости киназы/субстрата и митохондриальных ИПП.

Резюме отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в ^{Резюме отчета об исследовании природы} , связанном с этой статьей.

Дополнительная информация ^{(1.2M, pdf)}

Файл рецензирования ^{(477K, pdf)}

Резюме отчета ^{(114K, pdf)}

Мы благодарим Пунит Сараон за помощь в подготовке рисунка, Елену Томич за редактирование, Мэнди Лам и Микко Тайпале за предоставление доступа к оборудованию, а также Мэнди Лам, Микко Тайпале и Фредерика Рота за предоставление клонов кДНК. , R. Schmidt за помощь в создании штамма C. elegans . Работа в лаборатории Stagljar поддерживается Обществом исследования рака (№ 505486), Genome Canada через Ontario Genomics (#OGI-117, #OGI-159 и #OGI-120), Исследовательским фондом Онтарио (ORF/DIG-501411 и РЭ08-009), CIHR (#PJT-165862), грант FACIT Prospects Oncology (#507942) и CQDM (Quantum Leap). Эта работа была также поддержана грантом VICI Нидерландской организации научных исследований (NWO) 016.VICI.170.165 для M.B. Лаборатория Jurisica частично поддерживалась Исследовательским фондом Онтарио (№ 34876), Исследовательским советом по естественным наукам (NSERC № 203475) и Канадским фондом инноваций (CFI № 225404, № 30865).

Исходные данные

Исходные данные ^{(167M, zip)}

З.Я. концептуализировал SIMPL, активно участвовал в большинстве экспериментов и анализе данных и написал большую часть рукописи. Ф.А. провел несколько экспериментов. Ф.А., И.А. и П.Т. участвовали в подготовке ДНК. Дж. С. способствовал написанию рукописи. Дж. С. и A.L. помогли создать стабильные клеточные линии. Дж.К. и М.Б. провел C. elegans и написал соответствующую часть в рукописи. И.Дж. и М.К. выполнял вычислительный анализ RRS, помогал анализировать данные и участвовал в написании рукописи. ЯВЛЯЕТСЯ. руководил и руководил работой, участвовал в написании рукописи и координировал подготовку рукописи. Все авторы одобрили его содержание.

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью (и ее файлы с дополнительной информацией). Исходные данные для рисунков, представленных в основной рукописи, и дополнительная информация доступны в файле исходных данных. Все остальные соответствующие данные можно получить у авторов по обоснованному запросу.

И.С. и З.Ю. названы соавторами в заявке на патент, касающейся описанной технологии.

Информация о рецензировании Nature Communications благодарит анонимных рецензентов за их вклад в рецензирование этой работы. Доступны отчеты рецензентов.

Примечание издателя Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Дополнительная информация доступна для этого документа по адресу 10.1038/s41467-020-16299-1.

1. Yao Z, Petschnigg J, Ketteler R, Stagljar I. Руководство по применению омических подходов к сотовой сигнализации. Нац. хим. биол. 2015; 11: 387–397. doi: 10.1038/nchembio.1809. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Petschnigg J, Snider J, Stagljar I. Интерактивные технологии исследования протеомики: последние приложения и достижения. Курс. мнение Биотехнолог. 2011;22:50–58. doi: 10.1016/j.copbio.2010.09.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Snider J, et al. Основы картирования сети взаимодействия белков. Мол. Сист. биол. 2015; 11: 848–848. doi: 10.15252/msb.20156351. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Сутер Б., Киттанаком С., Стагляр И. Двухгибридные технологии в исследованиях протеомики. Курс. мнение Биотехнолог. 2008; 19: 316–323. doi: 10.1016/j.copbio.2008.06.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Гогартен Дж. П., Сенеджани А. Г., Жахыбаева О., Олендзенски Л., Иларио Э. Интейны: структура, функция и эволюция. Анну. Преподобный Микробиолог. 2002; 56: 263–287. doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.160741. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

6. Шах Н.Х., Мьюир Т.В. Интеины: подарок природы белковым химикам. хим. науч. 2014;5:446–461. doi: 10.1039/C3SC52951G. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

7. Аранко А.С., Влодавер А., Иваи Х. Рецепт природы для расщепления интеинов. Белок англ. Дес. Сел. 2014; 27: 263–271. doi: 10.1093/белок/gzu028. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

8. Wood DW, Camarero JA. Применение интеина: от очистки и мечения белков до методов контроля метаболизма. Дж. Биол. хим. 2014;289: 14512–14519. doi: 10.1074/jbc.R114.552653. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. Dassa B, London N, Stoddard BL, Schueler-furman O, Pietrokovski S. Сломанные гены: новое геномное расположение, включающее новые расщепленные интеины и новый семейство самонаводящихся эндонуклеаз. Нуклеиновые Кислоты Res. 2009; 37: 2560–2573. doi: 10.1093/nar/gkp095. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

10. Carvajal-Vallejos P, Pallisse Roser, Mootz HD, Schmidt SR. Выявлены беспрецедентные показатели и эффективность новых природных расщепленных интеинов из метагеномных источников. Дж. Биол. хим. 2012; 287:28686–28696. doi: 10.1074/jbc.M112.372680. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Beyer, H.M., Mikula, K.M., Li, M., Wlodawer, A. & Iwai, H. Кристаллическая структура естественно расщепленного gp41- 1 интеин направляет создание ортогональных расщепленных интеинов из цис-сплайсингового интеина. FEBS J (в печати) 10. 1111/февраль 15113 (2019). [Статья бесплатно PMC] [PubMed]

12. Choi J, Chen J, Schreiber SL, Clardy J. Структура комплекса FKBP12-рапамицин, взаимодействующего со связывающим доменом FRAP человека. Наука. 1996;273:239–242. doi: 10.1126/science.273.5272.239. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

13. Aranko aS, et al. Структурная инженерия и сравнение новых расщепленных интеинов для лигирования белков. Мол. Биосист. 2014;10:1023–1034. doi: 10.1039/C4MB00021H. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. Machleidt T, et al. NanoBRET — новая платформа BRET для анализа межбелковых взаимодействий. АКС хим. биол. 2015;10:1797–1804. doi: 10.1021/acschembio.5b00143. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

15. Venkatesan K, et al. Эмпирическая основа для картирования бинарных интерактомов. Нац. Методы. 2009; 6: 83–90. doi: 10.1038/nmeth.1280. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

16. Lievens S, et al. Датчик субстрата киназы (KISS), датчик взаимодействия белков in situ млекопитающих. Мол. Клетка. Протеомика. 2014;13:3332–3342. doi: 10.1074/mcp.M114.041087. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

17. Trepte P, et al. LuTHy: основанная на биолюминесценции двухгибридная технология двойного считывания для количественного картирования белок-белковых взаимодействий в клетках млекопитающих. Мол. Сист. биол. 2018;14:e8071. doi: 10.15252/msb.20178071. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Браун П. и соавт. Экспериментально полученная оценка достоверности для бинарных белок-белковых взаимодействий. Нац. Методы. 2009; 6: 91–97. doi: 10.1038/nmeth.1281. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

19. Леммон М.А., Шлессингер Дж. Передача сигналов клетками рецепторными тирозинкиназами. Клетка. 2010; 141:1117–1134. doi: 10.1016/j.cell.2010.06.011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

20. Zheng Y, et al. Временная регуляция сигнальных сетей EGF каркасным белком Shc1. Природа. 2013;499: 166–171. doi: 10.1038/nature12308. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

21. Пылаева-Гупта Ю., Грабочка Э., Бар-Саги Д. Онкогены РАН: плетение онкогенной сети. Нац. Преподобный Рак. 2011; 11: 761–774. doi: 10.1038/nrc3106. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

22. Petschnigg J, et al. Двухгибридный анализ мембран млекопитающих (MaMTH) для исследования мембранно-белковых взаимодействий в клетках человека. Нац. Методы. 2014; 11: 585–592. doi: 10.1038/nmeth.2895. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

23. Yao Z, et al. Общий анализ интерактома рецепторной тирозинкиназы-протеинфосфатазы. Мол. Клетка. 2017;65:347–360. doi: 10.1016/j.molcel.2016.12.004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

24. Feig LA, Cooper GM. Ингибирование пролиферации клеток NIH 3T3 мутантным белком ras с преимущественным сродством к GDP. Мол. Клетка. биол. 1988; 8: 3235–3243. doi: 10.1128/MCB.8.8.3235. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25. Юра Н. и соавт. Механизм активации каталитического домена рецептора EGF околомембранным сегментом. Клетка. 2009; 137:1293–1307. doi: 10.1016/j.cell.2009.04.025. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

26. Waas WF, Dalby KN. Переходные белок-белковые взаимодействия и случайный кинетический механизм фосфорилирования фактора транскрипции внеклеточно регулируемой протеинкиназой 2. J. Biol. хим. 2002; 277:12532–12540. doi: 10.1074/jbc.M110523200. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

27. Garai Á, et al. Специфичность линейных мотивов, которые связываются с общей бороздкой для стыковки митоген-активируемой протеинкиназы. науч. Сигнал. 2012;5:ra74. doi: 10.1126/scisignal.2003004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

28. Floyd BJ, et al. Картирование взаимодействия митохондриальных белков идентифицирует регуляторы функции дыхательной цепи. Картирование взаимодействия митохондриальных белков идентифицирует регуляторы функции дыхательной цепи. Мол. Клетка. 2016; 63: 621–632. doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.033. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

29. Джексон Т.Д., Палмер К.С., Стояновский Д. Митохондриальные заболевания, вызванные дисфункциональным импортом митохондриальных белков. Биохим. соц. Транс. 2018;46:1225–1238. doi: 10.1042/BST20180239. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

30. Козяк-Павлович В. Комплекс MICOS митохондрий человека. Сотовые Ткани Res. 2017; 367:83–93. doi: 10.1007/s00441-016-2433-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

31. Ciszak, E.M., Korotchkina, L.G., Dominiak, P.M., Sidhu, S. & Patel, M.S. пируватдегидрогеназы. 278 , 21240–21246 (2003 г.). [PubMed]

32. Boxem M, et al. Сеть интерактомов на основе белковых доменов для раннего эмбриогенеза C. elegans. Клетка. 2008; 134: 534–545. doi: 10.1016/j.cell.2008.07.009. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

33. Simonis N, et al. Эмпирически контролируемое картирование сети белковых интерактомов Caenorhabditis elegans. Нац. Методы. 2009; 6: 47–54. doi: 10.1038/nmeth.1279. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

34. Yaish P, Gazit A, Gilon C, Levitzki A. Блокирование EGF-зависимой пролиферации клеток ингибиторами киназы рецептора EGF. Наука. 1988; 242: 933–935. doi: 10.1126/science.3263702. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

35. Roberts AW, Stilgenbauer S, Seymour JF, Huang DCS. Венетоклакс у пациентов с ранее леченным хроническим лимфолейкозом. клин. Рак рез. 2017;23:4527–4534. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-0955. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

36. Souers AJ, et al. АБТ-199, мощный и селективный ингибитор BCL-2, проявляет противоопухолевую активность при сохранении тромбоцитов. Нац. Мед. 2013;19:202–208. doi: 10.1038/nm.3048. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

37. Стагляр И. Сила OMIC. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 2016; 479: 607–609. doi: 10.1016/j.bbrc.2016.09.095. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

38. Barrios-Rodiles M, et al. Высокопроизводительное картирование динамической сигнальной сети в клетках млекопитающих. Наука. 2005; 307:1621–1625. doi: 10.1126/science.1105776. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

39. Lemmens I, et al. Гетеромерный MAPPIT: новая стратегия изучения зависимых от модификации белок-белковых взаимодействий в клетках млекопитающих. Нуклеиновые Кислоты Res. 2003;31:e75. doi: 10.1093/nar/gng075. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

40. Fields S, Song O. Новая генетическая система для обнаружения межбелковых взаимодействий. Природа. 1989; 340: 245–246. doi: 10.1038/340245a0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

41. Galarneau A, Primeau M, Trudeau L, Michnick SW. Анализ комплементации белковых фрагментов β-лактамазы в качестве сенсоров межбелковых взаимодействий in vivo и in vitro. Нац. Биотехнолог. 2002;20:619–622. doi: 10.1038/nbt0602-619. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

42. Ramachandra N, et al. Самособирающиеся белковые микрочипы. Наука. 2004; 305:86–91. doi: 10.1126/science.1097639. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

43. Shah NH, Eryilmaz E, Cowburn D, Muir TW. Естественно расщепленные интеины собираются посредством механизма «захвата и коллапса». Варенье. хим. соц. 2013; 135:18673–18681. doi: 10.1021/ja4104364. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

44. Zheng Y, Wu Q, Wang C, Xu MQ, Liu Y. Взаимная синергетическая укладка белков в расщепленном интеине. Бионауч. Отчет 2012; 32: 433–442. DOI: 10.1042/BSR20120049. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

45. Michnick SW, Ear PH, Manderson EN, Remy I, Stefan E. Универсальные стратегии в исследованиях и открытии лекарств на основе анализов комплементации белковых фрагментов. Нац. Преподобный Друг Дисков. 2007; 6: 569–582. doi: 10.1038/nrd2311. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

46. Kim MW, et al. Временное определение белок-белковых взаимодействий с считыванием транскрипции. Элиф. 2017; 6:1–24. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

47. Ольховский М., и соавт. OpenFreezer: система программного обеспечения для управления информацией о реагентах. Нац. Методы. 2011; 8: 612–613. doi: 10.1038/nmeth.1658. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

48. Boussif O, et al. Универсальный вектор для переноса генов и олигонуклеотидов в клетки в культуре и in vivo: полиэтиленимин. проц. Натл. акад. науч. США. 1995;92:7297–7301. doi: 10.1073/pnas.92.16.7297. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

49. Котляр М., Пастрелло С., Малик З., Юриска И. Обновление IID 2018: контекстно-зависимые физические белок-белковые взаимодействия у человека, модельных организмов и домашних животных разновидность. Нуклеиновые Кислоты Res. 2019;47:D581–D589. doi: 10.1093/nar/gky1037. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

50. Котляр М. и др. Предсказание in silico физических взаимодействий белков и характеристика интерактомных сирот. Нац. Методы. 2014;12:79–84. doi: 10.1038/nmeth.3178. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

51. Бреннер С. Генетика Caenorhabditis elegans. Генетика. 1974; 77: 71–94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

---

Статьи от Nature Communications предоставлены здесь с разрешения Издательская группа Nature

---

Экспрессионная система Expi293 | Thermo Fisher Scientific

• Преимущества системы
• Дополнительные возможности Expi293
• Истории клиентов
• Заказ/дозаказ компонентов
• Технические ресурсы

Доверьтесь отраслевому стандарту экспрессии экспрессии HEK 293 с высокой производительностью.

Каждая минута на счету, когда дело доходит до сцеживания кандидатов в наркотики. Вот почему Gibco Expi293 Expression System — проверенный временем выбор для временной экспрессии в клетках 293 млекопитающих. Эта система быстрой высокопродуктивной продукции белка основана на культуре клеток Expi293F™ высокой плотности в экспрессионной среде Expi293™ и питается Expifectamine™ 293, реагентом для трансфекции на основе катионного липида. Все компоненты системы работают вместе, чтобы обеспечить доступ к рекомбинантным белкам, полученным из 293, всего за пять-семь дней с 2-10-кратным увеличением выхода белка по сравнению с системами временной экспрессии предыдущего поколения. Получите необходимое количество белка быстрее.
 

Преимущества системы экспрессии Expi293

• Превосходный выход белка
• Сохранение существующего формата
• Клетки в банке cGMP

Получайте больше белка, сокращая время работы и количество отходов

 Нажмите на изображение, чтобы увеличить его

Экспрессионная система Expi293 предназначена для доставки до 6 раз большего количества белка всего за одну неделю по сравнению с другими временными системами экспрессии 293, которые могут занять две недели и более. Отчасти это связано с тем, что Expi29Клетки 3F адаптированы для достижения более высокой производительности пг/кл/день, чем стандартные клетки HEK 293, а реагент для трансфекции Expifectamine 293 и энхансеры обеспечивают высокоэффективную трансфекцию и уровни экспрессии культур HEK 293 высокой плотности. Кроме того, для экспрессионной системы Expi293 требуется меньше пластиковой посуды, что означает меньше отходов и больше места в инкубаторе. На графике показана экспрессия человеческого IgG и Fc-меченого Cripto, достигающая уровня экспрессии более 1 г/л в экспрессионной системе Expi293.

См. данные выражения

Используйте предпочитаемый формат культуры без ущерба для урожайности

 Щелкните изображение, чтобы увеличить

Экспрессионная система Expi293 предназначена для поддержки надежного производства белка в различных сосудах для культивирования. В малых и больших форматах — и во всех промежуточных — вы можете экспрессировать необходимый вам белок. На графике показана экспрессия Fc-меченого Cripto, которая обеспечивает аналогичный объемный выход белка в трех разных масштабах.

Полностью задокументированные клетки из банка cGMP

На графике представлены эквивалентные титры кроличьего IgG, полученные в клетках Expi293F из банка cGMP и каталогизированных клеток Expi293F в масштабе 30 мл с использованием экспрессионной системы Expi293.

• Полностью задокументированная клеточная линия, хранящаяся в банке cGMP бесплатно Expi293 Система экспрессии для приложений, требующих хранения клеток в банке cGMP
• Гибкие варианты коммерческого лицензирования без роялти

См. информацию о продукте

Превосходный выход белка

Получайте больше белка, сокращая время работы и количество отходов

 Нажмите на изображение, чтобы увеличить

Экспрессионная система Expi293 предназначена для доставки до 6 раз большего количества белка всего за одну неделю по сравнению с другими переходными 293 системы экспрессии, которые могут занять две недели или больше. Отчасти это связано с тем, что клетки Expi293F адаптированы для достижения более высокой производительности пг/кл/день, чем стандартные клетки HEK 293, а реагент для трансфекции Expifectamine 293 и энхансеры обеспечивают высокоэффективную трансфекцию и уровни экспрессии HEK 293 высокой плотности. культуры. Кроме того, для экспрессионной системы Expi293 требуется меньше пластиковой посуды, что означает меньше отходов и больше места в инкубаторе. На графике показана экспрессия человеческих IgG и Fc-меченых Cripto, при этом уровни экспрессии достигают более 1 г/л в Expi29.3 Система экспрессии.

См. данные выражения

Сохраняйте существующий формат

Используйте предпочитаемый формат культуры без ущерба для урожайности

 Щелкните изображение, чтобы увеличить

Экспрессионная система Expi293 предназначена для поддержки надежного производства белка в различных сосудах для культивирования. В малых и больших форматах — и во всех промежуточных — вы можете экспрессировать необходимый вам белок. На графике показана экспрессия Fc-меченого Cripto, которая обеспечивает аналогичный объемный выход белка в трех разных масштабах.

клетки, хранящиеся в цГМФ

Полностью задокументированные клетки из банка cGMP

На графике представлены эквивалентные титры кроличьего IgG, полученные в клетках Expi293F из банка cGMP и каталогизированных клеток Expi293F в масштабе 30 мл с использованием экспрессионной системы Expi293.

• Полностью задокументированная клеточная линия, хранящаяся в банке cGMP0004
• Компонент полностью интегрированной экспрессионной системы Expi293 неживотного происхождения для приложений, требующих хранения клеток в банке cGMP
• Гибкие варианты коммерческого лицензирования без лицензионных платежей Что входит в систему Expi293 Expression?

  Экспрессионная система Expi293 объединяет высокоэкспрессирующую клеточную линию 293, бессывороточную культуральную среду определенного химического состава и высокоэффективный реагент для трансфекции со специализированными энхансерами.

  • 2 флакона с замороженными клетками Gibco Expi293F
  • 1 л экспрессионной среды Gibco Expi293
  • 1 набор для трансфекции Gibco ExpiFectamine 293, достаточный для трансфекции 1 л культуры экспрессирующий положительный контрольный вектор

  ---

  Дополнительные возможности Expi293 Transient Protein Expression System для структурной биологии и индуцируемой экспрессии

  Ожидайте большего от системы, которая трансформировала транзиентную экспрессию млекопитающих. Теперь представляем три дополнительные клеточные линии и набор для маркировки, которые открывают новые возможности в рамках Expi29.3 Временная система экспрессии белков. Благодаря функциям, поддерживающим структурную биологию и приложения для экспрессии индуцибельных белков, вы можете расширить свою работу с тем же невероятным выходом и сложной структурой, которые вы испытали с другими нашими системами экспрессии Expi293. Получите высокий выход, быстрое время до получения белка (всего 5–7 дней) и воспроизводимость, которую вы привыкли ожидать, с дополнительной гибкостью, подходящей для более широкого спектра применений и белков.

  Дополнительные возможности системы Expi293 включают:

  • Glycan modulation
  • Inducible expression
  • Methionine protein labeling
  • Expi293F GnTI- cell line
  • Expi293F Inducible GnTI- cell line
  • Expi293F Inducible cell line
  • Order now

  Expi293F GnTI- Cell Line

  Благодаря линейке клеток Expi293F GnTI-Cell вам больше не нужно жертвовать производительностью ради простоты. Эти клетки были разработаны для облегчения методов анализа, которые зависят от состояния гликозилирования белка.

  Основные преимущества:

  • Выход >30 раз выше, чем у следующего по эффективности продукта
  • Упрощенная структура гликанов

  Expi293F GnTI-клетки экспрессируют белки на уровнях, сравнимых с родительскими клетками Expi293. Для сравнения, уровни экспрессии клеток ATCC GnTI-, адаптированных к среде FreeStyle293 с трансфекцией PEI, более чем в 30 раз ниже, чем у клеток Expi293F GnTI- в системе Expi293.

  Экспрессия GPCR в Expi293 (дорожки 1-4) и Expi293 GnTI- (дорожки 5-8) в различных условиях экспрессии.

  Expi293F Индуцибельная клеточная линия GnTI

  Expi293F Индуцибельная клеточная линия GnTI можно добиться настраиваемой экспрессии гликан-модифицированных белков. Эти ячейки были разработаны для облегчения анализа сложных белков без добавления этапов рабочего процесса или снижения производительности в вашей работе по структурной биологии и других приложениях.

  Основные преимущества:

  • Более чем в 8 раз более высокая производительность по сравнению с существующим T-REx 293 клетки
  • Настраиваемая экспрессия белков
  • Упрощенные структуры гликанов
    

  После полной индукции в векторе pcDNA5.0/TO клетки Expi293F Inducible GnTI- экспрессируют белки на уровнях, сравнимых с родительскими клетками Expi293F. Для сравнения, уровни экспрессии клеток T-REx 293, адаптированных к среде FreeStyle293 с трансфекцией PEI, в 8 раз ниже, чем у индуцируемой клеточной линии Expi293F GnTI- в системе Expi293.

  Экспрессия GPCR с разным уровнем индукции.

   Щелкните изображение, чтобы увеличить

  Гликановые паттерны IgG человека, экспрессированные в (A) Expi293F и (B) Expi293F клеточных линиях GnTI.

  Линия индуцируемых клеток Expi293F

  Линия индуцируемых клеток Expi293F обеспечивает регулируемую и настраиваемую экспрессию белков, которые могут выиграть от более медленной кинетики экспрессии, таких как токсичные белки и мембранные белки. Эти клетки также были разработаны для облегчения изучения клеточных моделей, требующих регуляции экспрессии белков.

  Ключевые преимущества:

  • Выход >9 раз выше, чем у клеток T-REx 293
  • Настраиваемая экспрессия белков

  к родительским клеткам Expi293F. Для сравнения, уровни экспрессии клеток T-REx 293, адаптированных в среде FreeStyle293 с трансфекцией PEI, почти в 10 раз ниже, чем у индуцируемой клеточной линии Expi293F в системе Expi293.

  Клетки трансфицировали слитым с Fc белком в векторе pcDN5.0/TO, а затем индуцировали различными уровнями тетрациклина в зависимости от дозы.

  Expi293F GnTI- клеточная линия

  Expi293F GnTI- Cell Line

  С линейкой Expi293F GnTI- Cell вам больше не нужно жертвовать производительностью ради простоты. Эти клетки были разработаны для облегчения методов анализа, которые зависят от состояния гликозилирования белка.

  Основные преимущества:

  • Выход >30 раз выше, чем у следующего по эффективности продукта
  • Упрощенная структура гликанов

  Expi293F GnTI-клетки экспрессируют белки на уровнях, сравнимых с родительскими клетками Expi293. Для сравнения, уровни экспрессии клеток ATCC GnTI-, адаптированных к среде FreeStyle293 с трансфекцией PEI, более чем в 30 раз ниже, чем у клеток Expi293F GnTI- в системе Expi293.

  Экспрессия GPCR в Expi293 (дорожки 1-4) и Expi293 GnTI- (дорожки 5-8) в различных условиях экспрессии.

  Expi293F Индуцибельная клеточная линия GnTI

  Expi293F Индуцибельная клеточная линия GnTI

  Expi293F Индуцибельная клеточная линия GnTI можно добиться настраиваемой экспрессии гликан-модифицированных белков. Эти ячейки были разработаны для облегчения анализа сложных белков без добавления этапов рабочего процесса или снижения производительности в вашей работе по структурной биологии и других приложениях.

  Key benefits:

  • >8x higher yield over existing T-REx 293 cells
  • Tunable expression of proteins
  • Simplified glycan patterns
     

  Upon full induction in pcDNA5.0/TO vector, Expi293F Inducible GnTI – клетки экспрессируют белки на уровнях, сравнимых с родительскими клетками Expi293F. Для сравнения, уровни экспрессии клеток T-REx 293, адаптированных к среде FreeStyle293 с трансфекцией PEI, в 8 раз ниже, чем у клеток Expi29.3F Индуцибельная клеточная линия GnTI в системе Expi293.

  Экспрессия GPCR с разным уровнем индукции.

   Щелкните изображение, чтобы увеличить

  Гликановые паттерны IgG человека, экспрессированные в (A) Expi293F и (B) Expi293F клеточных линиях GnTI.

  Expi293F Индуцибельная клеточная линия

  Линия индуцируемых клеток Expi293F

  Линия индуцируемых клеток Expi293F обеспечивает регулируемую и настраиваемую экспрессию белков, которые могут выиграть от более медленной кинетики экспрессии, таких как токсичные белки и мембранные белки. Эти клетки также были разработаны для облегчения изучения клеточных моделей, требующих регуляции экспрессии белков.

  Ключевые преимущества:

  • Выход >9 раз выше, чем у клеток T-REx 293
  • Настраиваемая экспрессия белков

  к родительским клеткам Expi293F. Для сравнения, уровни экспрессии клеток T-REx 293, адаптированных в среде FreeStyle293 с трансфекцией PEI, почти в 10 раз ниже, чем у индуцируемой клеточной линии Expi293F в системе Expi293.

  Клетки трансфицировали слитым с Fc белком в векторе pcDN5.0/TO, а затем индуцировали различными уровнями тетрациклина в зависимости от дозы.

  Заказать сейчас

  Набор для маркировки белка Expi293 Met(–)

  Используйте наш набор Expi293 для мечения белков с дефицитом метионина, который упрощает структурно-биологические исследования с помощью рентгеновской кристаллографии и ЯМР с использованием суспензионных культур млекопитающих с высоким титром.

  Основные преимущества:

  • Единая маркировка остатков метионина
     

  (A) Экспрессия белка с добавлением метил-13С-метионина в различные моменты времени перед трансфекцией. (B) . Экспрессия белка с добавлением селенометионина в различные моменты времени до трансфекции.

  Сравнение теоретических спектров для пептида, содержащего селенометионин, и экспериментальных спектров для смеси нативного и SeMet-меченого пептида.
   

  Истории клиентов Expi293 Expression System

  «Я могу производить больше белка в меньшем объеме и за меньшее время, это фантастика! получаем то, что нам нужно. Он надежный, масштабируемый и воспроизводимый. Это здорово».

  — Джо Шеффер, старший научный сотрудник AnaptysBio, Inc.

  «За все годы моей работы с системами транзиентной экспрессии система экспрессии Expi293 стала первой, достигшей уровня 2,3 грамма на литр, превзойдя любую другую систему транзиентной экспрессии HEK293».

  

  — Крупная фармацевтическая компания

  ‹›

  Expi293 экономически эффективен по сравнению с другими средами FreeStyle 293

  ПРИМЕЧАНИЕ. Сравнение затрат основано на прейскурантной цене в долларах США и выходе белка 1 г/л с экспрессионной системой Expi293.

  	PEI w/ FreeStyle 293 Medium	Expi293 System (typically delivers 5x yield)
  Cost of 1 L transfection	$548	$1,531
  Culture volume for equivalent yield	1 L	200 мл
  Общая стоимость за такое же количество белка	607 $	324 $

  Рассчитайте свою экономию с Expi293 1

  11

  11 Информация для заказа

  Повторный заказ компонентов системного комплекта Expi293

  Заказать сопутствующие товары

  Индивидуальные носители

  Мы предлагаем полный спектр инновационных продуктов и услуг, в том числе быструю и гибкую разработку клеточных линий, среды и каналы, передовые технологии, разработку качественных пользовательских сред и услуги по оптимизации сред.

  Узнайте больше о том, как мы можем настроить формулу и формат вашей среды

  Стерильные одноразовые колбы Эрленмейера Thermo Scientific Nalgene

  Стерильные одноразовые колбы Thermo Scientific Nalgene изготовлены из легкого, ударопрочного и кристально чистого ПЭТГ, поэтому вы можете с уверенностью сцеживаться. Все размеры доступны в вентилируемых и невентилируемых форматах, а также с простым или перегородчатым дном для использования на столе или шейкерном столе.

  См. протокол для колб, валидированных с помощью системы Expi293 Expression

  Ресурсы

  Поддерживать

  Технические вопросы?

  • Связаться со службой технической поддержки

  Онлайн-обучение

  • Посмотреть все веб-трансляции с виртуального мероприятия Gibco ExpressionWorld

  Публикации

  Центр публикаций Protein Expression
  Доступ к кураторскому списку публикаций, в которых освещаются преимущества наших экспрессионных систем Expi.

  • Открытые и закрытые структуры выявляют аллостерию и податливость шипа оболочки ВИЧ-1 (2017 г.)
  • Люминесцентная система иммунопреципитации (LIPS) для выявления аутоантител к субъединицам АТФ4А и АТФ4В желудочной протонной помпы Н+,К+-АТФазы в атрофическом организме больных гастритом (2017)
  • Точно формованные наночастицы, содержащие белки DENV-E, вызывают устойчивые серотип-специфические ответы нейтрализующих антител (2016 г.)
  • ENPP1 обрабатывает АДФ-рибозилирование белков in vitro (2016 г.) питательные среды с медью(II) (2016)
  • Эффективная оптимизация аффинности антител с помощью фагового дисплея в сочетании с технологиями высокопроизводительного синтеза ДНК и секвенирования (2015)
  • Экспрессия и характеристика рекомбинантной, тетрамерной и ферментативно активной нейраминидазы гриппа для подготовки ферментативно-связанного анализа на основе лектина (2015 г.)
  • Новое биспецифическое антитело против человеческого CD3 и рецептора эфрина A10 для лечения рака молочной железы (2015 г. )

  Часто задаваемые вопросы: клеточные линии HEK293 | InvivoGen

  Описание клеточной линии

  Где экспрессируются эндосомальные TLR (TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9) в клетках HEK-Blue™?

  Мы предполагаем, что они находятся в эндосомах, поскольку мы экспрессируем полноразмерные гены дикого типа. Кроме того, их сигнал может быть заблокирован хлорохином, ингибитором эндосомального закисления. Однако, поскольку эти TLR сверхэкспрессированы, потенциально может быть низкая их экспрессия на клеточной поверхности.

  Экспрессируют ли клетки HEK293 какие-либо эндогенные рецепторы распознавания образов (PRR)?

  Клетки HEK293 экспрессируют TLR1, TLR3, TLR5, TLR6 и NOD1.
  Они реагируют на агонисты TLR3, TLR5 и NOD1, но на гораздо более низком уровне по сравнению с HEK293 клетки, трансфицированные этими рецепторами.

  Есть ли у вас какая-либо информация о классификации GM клеточных линий, трансфицированных HEK293?

  В Соединенных Штатах линии клеток HEK293 обозначены как уровень биобезопасности 2 в соответствии с Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC).
  В Германии клеточным линиям HEK293 присвоен уровень биологической безопасности 1 в соответствии с Центральным комитетом биологической безопасности, Центральной комиссией по биологической безопасности (ZKBS).
  Вы можете узнать об использовании этих элементов в регулирующем органе вашей страны. 908:43 Обратите внимание, что в этих клетках нет реплицирующегося/инфекционного аденовируса 5.

  В чем разница между клетками HEK-Blue™ Null1 и HEK-Blue™ Null2 (родительские клеточные линии клеток HEK-Blue™)?

  Минимальный промотор не одинаков, но разница в экспрессии этих двух нулевых клеточных линий незначительна.

  Что касается конструирования репортерных клеточных линий InvivoGen, то как плазмиды стабильно интегрируются в клетки HEK-Blue™?

  Для создания наших стабильных клеточных линий не существует какой-либо конкретной системы интеграции.
  Давления отбора достаточно для получения стабильных клонов. Рецепторы добавляют путем простой трансфекции плазмид с использованием катионного липидного трансфекционного агента (плазмиды не линеаризуют перед трансфекцией).

  Есть ли у вас различные клетки HEK-Blue™ Null, не устойчивые к G418?

  Только наши ячейки HEK-Blue™ Null1-k и Null2-k чувствительны к G418.

  Есть ли у вас различные нулевые клетки HEK-Blue™, не устойчивые к пуромицину?

  Единственными клетками HEK-Blue™ Null, чувствительными к пуромицину, являются клетки HEK-Blue™ Null1-v.

  Имеются ли у вас клетки HEK-Blue™ Null, не устойчивые к пуромицину?

  Единственными клетками HEK-Blue™ Null, чувствительными к пуромицину, являются клетки HEK-Blue™ Null1-v.

  Экспрессируют ли клетки HEK-Blue™ Fc-рецепторы?

  Наши данные RNAseq подтверждают, что наши клетки HEK-Blue™ экспрессируют FcRN, однако это не было функционально проверено.

  В чем разница между активностью сверхэкспрессированного TLR и эндогенного TLR в клетках HEK-Blue™?

  Разница в активности примерно в 10 раз

  В чем разница между клетками 293-TLR и клетками HEK-Blue™ TLR?

  Оба типа клеток сверхэкспрессируют обозначенный TLR. Основное отличие заключается в том, что клетки HEK-Blue™ включают репортерную конструкцию SEAP, индуцируемую NFκB.

  В чем разница между ячейками HEK-Blue™ и HEK-Dual™?

  Клетки HEK-Blue™ экспрессируют только один репортерный ген SEAP, индуцируемый NFκB. Принимая во внимание, что клетки HEK-Dual™ имеют добавление гена Lucia™, нокаутированного в локусе IL-8. Таким образом, когда IL-8 активируется после стимуляции, клетки HEK-Dual™ могут сообщать об этом секрецией люциферазы Lucia™.
  Следует также отметить, что клетки HEK-Dual™ были нокаутированы по TLR3, TLR5 и TNFR, чтобы ограничить влияние других TLR при изучении специфического пути TLR.

  В чем разница между клетками HEK-Blue™ IL-1R и HEK-Blue™ IL-1β?

  Клетки HEK-Blue™ IL-1R экспрессируют как человеческие, так и мышиные рецепторы IL-1β, поэтому могут обнаруживать оба вида.
  С другой стороны, клетки HEK-Blue™ IL-1β специфичны к человеческому IL-1β, но все же могут обнаруживать более высокие концентрации мышиного IL-1β.

  Культура клеточной линии

  Какой коэффициент деления вы рекомендуете для клеток HEK Blue™ после того, как флакон станет конфлюэнтным?

  Коэффициент разделения будет зависеть от того, когда вы ожидаете слияния. Обычно время удвоения клеток HEK-Blue™ составляет приблизительно 24 часа.
  Таким образом, если вы используете соотношение разделения 1:2 (50%) в новой колбе, клетки должны стать конфлюэнтными на следующий день. Если вы используете коэффициент разделения 1: 4 (25%), вы можете ожидать, что клетки станут сливными через 2 дня.

  Какое количество антибиотика HEK-Blue™ Selection вы бы посоветовали использовать?

  Наш набор HEK-Blue™ Selection поставляется в тюбиках объемом 1 мл, каждый из которых содержит раствор 250X.
  Таким образом, вы должны развести HEK-Blue™ Selection 1:250 в своей среде, чтобы получить концентрацию 1X.

  При какой плотности следует высевать клетки HEK-Blue™?

  Клетки HEK-Blue™ следует высевать с плотностью приблизительно 1,5 x 10 ⁶ клеток/мл в колбу T25 или 4 – 5 x 10 ⁶ клеток/мл в колбе Т75.

  Какие планшеты для культивирования клеток вы рекомендуете использовать с репортерными клетками HEK-Blue™?

  Мы рекомендуем использовать планшеты для культивирования клеток с плоским дном и прозрачными стенками.

  У меня возникли проблемы с выращиванием клеток HEK. Есть ли у вас какие-либо советы для моей исходной культуры?

  Ниже приведены несколько советов, которые мы рекомендуем для ускорения роста клеток НЕК:
  • Для первых 2-3 пассажей выращивайте клетки в среде, содержащей 20 % FBS и не содержащей антибиотиков.
  • Не позволяйте ячейкам достигать 100% слияния Проверяйте ячейки как можно чаще.
  • Клетки не следует слишком долго выращивать в 20% FBS. Используйте среду с 10% FBS после 2 или 3 пассажей.
  • При производстве замороженных запасов продолжайте выращивать дополнительные культуры на случай возникновения проблем с замороженным запасом.

  Почему трипсин не рекомендуется для отделения клеток HEK-Blue™?

  Трипсин не оказывает неблагоприятного воздействия на здоровье или рост этих клеток. Однако известно, что высокие концентрации иногда вызывают активацию NFκB, что приводит к более высокому фону в вашем анализе.
  Кроме того, мы наблюдали несколько случаев, когда трипсин был загрязнен примесями TLR2, TLR4 и TLR5, что также может повлиять на результаты анализа.

  У меня есть несколько разных клеток HEK-Blue™ TLR. Почему они растут с разной скоростью?

  Нет ничего необычного в том, что разные клетки TLR растут с разной скоростью. Некоторые клоны TLR растут немного медленнее/быстрее, чем другие. Это часто зависит от клона.

  Мои ячейки HEK-Blue™ неправильно прикрепляются ко дну колбы. Какой тип пластикового оборудования вы рекомендуете?

  Когда клетки HEK-Blue™ не прилипают, это означает, что они либо были слишком сильно разбавлены в начале, либо они разрослись до чрезмерной конфлюэнтности в маленьком флаконе и задохнулись.
  Во избежание этого в будущем:
  • Замените среду и высейте клетки с плотностью примерно 1,5 x 10 ⁶ клеток/мл в колбу T25.
  • Промойте клетки перед тем, как поместить их в новую колбу. Иногда, когда клетки не прилипают, это происходит из-за скопления как живых, так и мертвых клеток. Кроме того, это позволит избавиться от любого оставшегося ДМСО, который может повлиять на адгезию клеток к колбе.
  • Используйте среду с 20% FBS.
  • Использование колб CellBIND иногда может помочь улучшить прикрепление и рост клеток (однако в обычном протоколе колбы CellBIND не требуются).

  Анализы

  После проведения анализа все лунки планшета становятся синими, даже отрицательный контроль. В чем может быть проблема?

  Есть 2 возможных объяснения того, почему во всех лунках наблюдается синий цвет.

  1. Это может быть связано с присутствием щелочной фосфатазы (ЩФ) в культуральной среде. Чтобы проверить, так ли это, можно провести очень простой тест. Добавьте 50 мкл среды, используемой для культивирования клеток (без клеток), и 200 мкл ресуспендированной среды для детекции HEK-Blue™ или QUANTI-Blue™. Если среда становится синей, то это связано с наличием щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке среды. В этом случае необходимо нагреть сыворотку для инактивации АР и повторить тест среды. В этот момент тест должен дать отрицательный результат (без синего цвета).

  2. Это может быть связано с неправильным обращением с ячейками перед тестом. Чтобы избежать активации NFκB перед стимуляцией и снизить риск ложноположительных результатов:
  • Используйте предварительно нагретый PBS для промывания клеток
  • Используйте термоинактивированный FBS
  • Не центрифугируйте клетки перед стимуляцией
  • Не используйте трипсин

  Можем ли мы использовать HEK-Blue™ Detection вместо QUANTI-Blue™ для репортерных клеток цитокинов HEK-Blue™?

  Мы заметили потерю чувствительности при использовании среды для детекции HEK-Blue™ вместо QUANTI-Blue™ на наших репортерных клеточных линиях цитокинов.
  Поэтому мы рекомендуем использовать QUANTI-Blue™, который поставляется вместе с ячейками, так как мы используем его дома.

  Можно ли использовать HEK-Blue™ Selection во время анализов?

  Мы рекомендуем вообще не использовать антибиотики во время анализов, чтобы обеспечить наименьшее количество потенциальных мешающих агентов в среде.
  Поэтому мы не добавляем HEK-Blue™ Selection в тестовую среду.

  Можно ли использовать линии репортерных клеток HEK-Blue™ для образцов плазмы или сыворотки? Если да, то что дает наилучшие результаты, образцы плазмы или сыворотки?

  Мы протестировали использование образцов плазмы и сыворотки только на нашей клеточной линии HEK-Blue™ hTLR2.
  Результаты показали, что по сравнению со стандартными образцами (в DMEM) образцы сыворотки дают разницу в один логарифм.
  С другой стороны, мы обнаружили 3-логарифмическую разницу между образцами DMEM и плазмы.
  Вот почему мы рекомендуем использовать образцы сыворотки вместо образцов плазмы.

  Можно ли одновременно использовать HEK-Blue™ Detection и QUANTI-Blue™ на клетках HEK-Blue™ TLR?

  Да, их можно использовать взаимозаменяемо. Однако обратите внимание, что протоколы явно различаются и должны соблюдаться соответствующим образом.

  Насколько легко трансфицировать клетки HEK293?

  Клетки HEK293 очень легко трансфицировать с эффективностью трансфекции приблизительно 80%.

  Можно ли увидеть результаты анализа HEK-Blue™ Detection менее чем за 16 часов?

  Это зависит от клеточной линии и концентрации лиганда, используемого для стимуляции клеток. Как правило, мы фиксируем результаты после 16-24 часов стимуляции.

  Основная линия клеток человека с неожиданным происхождением

  Клетки HEK 293 и производные от них клеточные линии широко используются в исследованиях и биотехнологии. Понимание их происхождения, возможностей и ограничений необходимо для получения оптимальных результатов, которые мы обсуждаем здесь.

  Создание иммортализованной клеточной линии из клеток почек

  Клеточные линии, такие как клетки HEK293, имеют решающее значение для таких областей, как биотехнология, фундаментальные исследования в области клеточной биологии и биомедицинские методы лечения будущего. Как правило, описание «клеточной линии» предназначено для иммортализованных клеток млекопитающих, которые можно непрерывно культивировать в течение времени от нескольких недель до месяцев без ухудшения состояния, а некоторые хорошо охарактеризованные клеточные линии даже размножались в течение многих десятилетий.

  Эта непрерывность и воспроизводимость сделали клеточные линии неотъемлемой частью многих начинаний и резко контрастируют с обычным поведением клеток млекопитающих, а именно с остановкой роста после определенного количества делений, определяемого пределом Хейфлика. Методы создания иммортализованных клеточных линий различаются и включают в себя начало от уже иммортализованных раковых клеток (таких как клетки HeLa), а также введение вирусных генов или генов млекопитающих, таких как теломераза, для осуществления неограниченной пролиферации. Поскольку метод иммортализации влияет на полученную клеточную линию, происхождение широко используемой клеточной линии, такой как HEK293 может быть подсветкой для работы с ним.

  В 1973 году Фрэнк Грэм (постдоктор в группе Алекса ван дер Эба в Нидерландах) культивировал клетки почек эмбрионов человека (HEK) для создания иммортализованной клеточной линии путем трансфекции ДНК аденовируса типа 5. Путем интеграции в геном клеток ДНК аденовируса должна предотвращать остановку клеточного цикла и, следовательно, обеспечивать возможность непрерывного размножения полученной клеточной линии. Из всех экспериментов, проведенных Грэхемом и ван дер Эбом, только один клон выжил в этом нелегком деле. К сожалению, этот процесс оказался не очень эффективным и название клеточной линии — HEK29.3 — результат системы нумерации, то есть это 293-й эксперимент. Клетки HEK293, происходящие от плода женского пола, сегодня являются одними из наиболее часто используемых клеточных линий млекопитающих для широкого спектра применений из-за простоты их трансфекции, а также культивирования.

   

  Несмотря на происхождение из ткани почек, клетки HEK293 снова и снова проявляли свойства незрелых нейронов. Это любопытное поведение привело к тщательной характеристике этой важной клеточной линии, показав, что геномика и транскриптомика HEK293 клетки больше всего напоминают клетки надпочечников, эндокринные клетки, вырабатывающие стероидные гормоны. Поскольку клетки надпочечников подобны нейрональным клеткам, клетки HEK293 действительно преимущественно входят в нейрональные клоны при спонтанной дифференцировке. Исходный аденовирус, по-видимому, отдавал предпочтение этому типу клеток, что объясняет низкую эффективность получения клеточной линии НЕК из клеток почек. Эти анализы также показали, что ДНК аденовируса интегрирована в хромосому 19 и что клетки HEK293 обычно несут 64 хромосомы, что во многих аспектах отличает их поведение от первичных клеток человека.

  От одного ко многим – HEK293 и производные от него клеточные линии

  Хотя клетки HEK культивируются во многих лабораториях по всему миру, эти клетки не обязательно являются HEK293. Был создан ряд производных клеточных линий, исходящих наружу от исходной клеточной линии, которые лучше всего подходят для ряда приложений. Введение большого Т-антигена вируса SV40 привело к созданию клеток HEK293T, что сделало возможной репликацию трансфицированных плазмид с началом репликации SV40. Это изменение сделало HEK293T-клетки привлекательны для производства больших количеств рекомбинантных белков или вирусных частиц, поскольку высокие уровни плазмид могут быть достигнуты с помощью временных трансфекций.

  Как HEK293, так и HEK293T представляют собой адгезивные клеточные линии, которые образуют стабильное соединение с чашками для культивирования клеток с покрытием. Это ограничивает их объем двумерным пространством. Таким образом, клетки HEK293F были выбраны для культивирования в суспензии путем адаптации, поднимающей их в трехмерное пространство и позволяющей более эффективно выращивать клеточные культуры высокой плотности для производства рекомбинантного белка в биореакторах. Клеточная линия HEK293FT дополнительно объединяет преимущества HEK293T и HEK293F за счет введения большого Т-антигена SV40 в клетки HEK293F. Наряду со многими дополнительными производными клеточными линиями следует упомянуть HEK293SG. Полученные из клеточной линии HEK293S, культивируемой в суспензии, HEK293SG предназначены для производства гомогенно гликозилированных биофармацевтических препаратов путем делеции MGAT, ключевой точки механизма гликозилирования.

  Аутентификация клеток HEK293

  Работа с неправильной клеточной линией поразительно распространена. По оценкам, 20% всех экспериментов не проводятся на намеченной клеточной линии, что может привести к искажению результатов и пустой трате времени и ресурсов. Наиболее часто перекрестное загрязнение демонстрируют клетки HeLa, которые могут быть особенно агрессивными и быстрорастущими. К этой ситуации приводят как перекрестное загрязнение, так и простая неверная идентификация/неправильная маркировка, и многие журналы и репозитории клеточных линий начали исправлять это, требуя идентификации клеточных линий, поскольку менее половины всех исследователей регулярно аутентифицируют свои клеточные линии.

  В то время как многие ошибочные определения клеточных линий уже могут быть исправлены с помощью визуального осмотра, анализ коротких тандемных повторов (STR) представляет собой золотой стандарт аутентификации клеточных линий. В этом генетическом методе, который также используется в криминалистике, характерные повторяющиеся области из 2-5 пар оснований подвергаются фингерпринтингу ДНК для быстрой и недорогой аутентификации. Важно отметить, что клеточные линии, такие как HEK293, с приобретенными мутациями в генах восстановления несоответствия, могут изменять свои характерные повторы при длительном культивировании, что приводит к отрицательным результатам аутентификации с помощью SPR.

  Области применения клеток HEK293

  Одно из основных применений HEK293 и производных клеточных линий заключается в фундаментальных исследованиях, поскольку они позволяют детально изучать белки человека на клеточном фоне. Для этого клетки обычно необходимо трансфицировать интересующим геном. Клетки HEK293 особенно легко трансфицировать и культивировать, что привело к их известности в исследовательском сообществе. Существует множество методов трансфекции, разделенных на временную трансфекцию для экспрессии белка в течение нескольких дней (обычно с молекулой адъюванта, связывающейся с плазмидной ДНК и обеспечивающей ее поглощение клеткой) и стабильную трансфекцию для экспрессии белка в течение нескольких месяцев (путем геномной интеграции через вирусы или транспозоны). Затем можно легко исследовать белковое взаимодействие, локализацию или поведение.

  Другим широко распространенным применением клеточных линий, полученных из HEK293, является производство рекомбинантных белков, требующих либо фолдинга, либо посттрансляционных модификаций, характерных только для клеток млекопитающих. Биофармацевтические препараты могут быть ярким примером этих рекомбинантных белков с постоянно растущей долей самых прибыльных лекарств и быстро растущими биотехнологическими возможностями. Это приложение в основном выполняется с суспензионными клеточными линиями, такими как HEK293F, выращенными в биореакторах. Для оптимизации продукции белка трансгены обычно стабильно трансфицируют с последующим отбором клональных клеточных линий с лучшими характеристиками продукции.

  Наконец, клетки, полученные из HEK293, обычно используются для получения вирусных частиц, таких как лентивирусные частицы, которые, в свою очередь, могут использоваться, например, для трансдукции неделящихся клеток. Здесь преимущественно используются адгезивные клеточные линии, модифицированные большим Т-антигеном SV40.

  Родственные клеточные линии млекопитающих

  При поиске родственных клеточных линий ключевой является цель. Различные клеточные линии специализируются на различных аспектах, и для достижения оптимальных результатов не существует идеальной клеточной линии. Для тех, кто заинтересован в фундаментальных исследованиях или тестировании лекарств, другие клеточные линии человека, такие как колоректальная клеточная линия Caco-2 или клеточная линия рака молочной железы MCF-7, могут быть подходящими вариантами. В качестве альтернативы для производства рекомбинантного белка, особенно для производства антител, клетки яичника китайского хомячка (CHO) являются одними из наиболее важных клеточных линий. Наконец, размножение или производство вирусов должно осуществляться в допустимых клеточных линиях для соответствующего вируса, таких как клетки Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) для вирусов гриппа.

  Выбор «лучших» расщепленных флуоресцентных белков для ваших приложений

  С тех пор, как наша первая статья об улучшенных расщепленных флуоресцентных белках была опубликована в Nature Communications в 2017 году, мой советник профессор Бо Хуан и я постоянно получали электронные письма с вопросами о том, как выбрать « лучшие» разделенные FP для своих конкретных нужд. В итоге я потратил большую часть своего «инкубационного времени» (время ожидания во время нескольких циклов окрашивания и промывки), отвечая на эти вопросы пункт за пунктом, так же тщательно, как я писал ответное письмо опытному рецензенту.

  В сентябре этого года наша новая статья, посвященная расщеплению sfCherry3 и его применению в многоцветной визуализации нейронных синапсов, вышла на Communications Biology . Подобные вопросы снова начали появляться в моем почтовом ящике. Я решил воспользоваться этим шансом, чтобы обобщить свой опыт разработки разъемных FP _1-10/11 , описать некоторые свойства, основанные на моих наблюдениях, и, надеюсь, ответить на ваш вопрос о «наилучшем выборе».

  Сплит mNeonGreen2 самый яркий среди всех?

  «Яркость» — расплывчатое утверждение, зависящее от клеточной среды. Если вы хотите эндогенно пометить хорошо экспрессируемый белок в цитозоле с помощью CRISPR, нокаутирующего FP ₁₁ , простой ответ — «Да». На уровне одиночных молекул (когда процесс комплементации завершен) яркость mNeonGreen2 _1–10/11 намного выше, чем у GFP _1–10/11 . Однако на массовом уровне эффективность комплементарности между FP _1-10 и FP 9Фрагменты 0453 11 могут сильно различаться: GFP _1–10/11 составляет почти 100%, тогда как mNeonGreen2 _1–10/11 составляет менее 50%. В этом случае, если вы не можете довести комплементацию до насыщения за счет чрезмерной экспрессии FP _1-10 в цитозоле (или любом конкретном клеточном компартменте), использование расщепленного GFP может фактически дать вам более качественные изображения. Что касается всех разделенных FP красного цвета, то они относительно тусклее. Поэтому, если ваш зеленый канал не был занят, начните с mNeonGreen2 _1–10/11 .

                     

  Рис. 1. Измерение яркости одной молекулы расщепленных FP и их полноразмерных аналогов, демонстрирующее отсутствие существенной разницы между расщепленными и полноразмерными.

  Есть ли разница в производительности между разделенным sfCherry3C и sfCherry3V?

  В этой работе мы сообщили о двух расщепленных вариантах sfCherry3 и старались не ранжировать один над другим при написании рукописи. Расщепленный sfCherry3C был лучшим мутантом, полученным в результате скрининга случайного мутагенеза, в то время как sfCherry3V был намеренно разработан путем введения мутации L83W, вдохновленной вариантом mCherry с круговой пермутацией (с повышенной эффективностью сворачивания белка). Наше первоначальное намерение — улучшить sfCherry3C 9.0453 1–10/11 эффективность комплементации, чтобы общая яркость была выше. К сожалению, мы не наблюдали общего увеличения флуоресцентного сигнала для нескольких белков-мишеней, помеченных посредством эндогенного нокаута. Но мы получаем более четкие и чистые структуры ER (эндоплазматического ретикулума), используя sfCherry3V _1-10 . Наше объяснение заключается в том, что материнский белок sfCherry имеет такую ​​стабильную основу, которая устойчива к лизосомной деградации. При мечении белков, участвующих в эндосомальном пути, который обычно заканчивается в лизосомах, они, как правило, агрегируются внутри и сохраняют светящуюся флуоресценцию. Эти гранулоподобные скопления маскируют красивую структуру исходных мишеней (таких как канальцы ER). Мутация L83W потенциально может дестабилизировать ригидный остов и сделать его более уязвимым для лизосомной деградации. Одним из доказательств является то, что мы не видели каких-либо гранулоподобных скоплений в клеточных линиях с нокаутом после перехода на sfCherry3V 9. 0453 1–10/11. Короче говоря, если интересующий вас белок будет проходить через эндосомы, сначала попробуйте sfCherry3V; в противном случае sfCherry3C, как правило, является хорошим выбором.

  Рисунок 2. Мечение эндогенного белка в клетках HEK 293T с использованием вариантов sfCherry3. RAB11A и ARL6IP1 участвуют в эндосомальном пути. Микроскопические изображения с sfCherry3V четкие и имеют менее точечную структуру.

  Будет ли тандемная метка FP11 всегда давать пропорциональное усиление сигнала?

  Это НЕ правда. Для разделенных FP, имеющих ~ 100% комплементацию, мы наблюдали линейное улучшение сигнала флуоресценции в зависимости от числа копий меток FP ₁₁ (единственный случай в GFP _1–10/11 ). Однако, учитывая неполную комплементацию, мы не достигли пропорционального усиления сигнала при использовании mNeonGreen2 ₁₁ , потенциально ограниченного уровнем экспрессии фрагмента mNeonGreen2 _1–10 . У нас есть еще одна расширенная версия под названием mNeonGreen3 _1–10/11 , который демонстрирует улучшенное усиление сигнала в тандемных метках. Альтернативный способ повысить общую яркость маркировки — помочь дополнению посредством взаимодействия SpyTag/SpyCatcher.

  В заключение отметим, что не существует единого стандарта для выбора наилучшего разделенного FP для всех биологических приложений. С таким уникальным и обширным применением инструмента расщепленного флуоресцентного белка мы можем с уверенностью ожидать, что колесо эволюции, управляемое молекулярными инженерами, никогда не остановится.

  Ссылки:

  Фэн, С., Варшней, А., Вилла, Д.С., Модави, К., Колер, Дж., Фарах, Ф., Чжоу, С., Али, Н., Мюллер, Дж.Д., Ван Ховен, М.К. и Huang, B., 2019. Ярко-расщепленные красные флуоресцентные белки для визуализации эндогенных белков и синапсов. Биология коммуникации , 2 .
  

  Фэн, Сию, Саяка Секине, Вероника Пессино, Хань Ли, Мануэль Д. Леонетти и Бо Хуанг. «Улучшенные расщепленные флуоресцентные белки для мечения эндогенных белков». Связь с природой  8, вып. 1 (2017): 370.

  HEK 293T Протоколы культивирования тканей

  Расщепление клеток

  Материалы и реагенты:

  • Среда HEK293T
  • Фосфатно-солевой буфер (PBS)
  • Трипсин
  • Шкаф биобезопасности
  • Стерильные пипетки на 10 и 5 мл
  • Вакуумный аппарат с автоклавируемыми пипетками Пастера.
  • Колба для культивирования клеток Т-75 (или чашка Петри на 60 мл для меньших культур).

  Шаги:

  1. Подготовка шкафа биобезопасности

     1. Выключить УФ-свет.
     2. Включить вентиляцию и освещение.
     3. Открыть дверцу шкафа в рабочее положение (см. метки на дверце шкафа).
     4. Опрыскайте внутренние поверхности шкафа 70% этанолом и протрите.

  2. Внесите материалы и реагенты в бокс биобезопасности.

     1. Опрыскайте 70% этанолом и протрите все поверхности перед помещением их в шкаф.
     2. Будьте осторожны при использовании стерильных реагентов или фильтрации нестерильных реагентов.
  3. Используйте вакуумный аппарат и пипетку Пастера для аспирации старых сред.

  4. Промыть 3–5 мл PBS (2 мл в чашке Петри на 60 мл).

     1. Пипетируйте на стенку чашки/колбы, а не на поверхность, на которой лежат клетки, чтобы избежать их смывания водой.
  5. Аспирация PBS.

  6. Добавить 3 мл трипсина (1 мл в чашку Петри на 60 мл)

     1. На этот раз вы действительно хотите нанести трипсин на поверхность, содержащую клетки.
  7. Оставьте на 3-5 минут, пока все клетки не станут свободно плавать (видно в микроскоп).

  8. Добавьте 7 мл среды (2 мл среды в чашку Петри на 60 мл) и перемешайте, пока клетки равномерно не распределятся по раствору.

     1. Многократно всасывайте суспензию пипеткой, а затем сливайте в колбу, разрушая таким образом клеточные цепочки и группы. 92 колбы для клеточных культур (или чашка Петри на 60 мл).
     2. Q.S. до 25 мл среды + клетки в новой колбе (или чашке).
     3. Аспирируйте неиспользованный клеточный раствор и утилизируйте использованную культуральную посуду.
     4. Пометьте новую колбу клеточной линией, PD (удвоение популяции; способы расчета см. в разделе «Основной пассаж клеток/культура»), соотношением разделения (1:20–1:2), инициалами и датой.
     5. Хранить колбу во влажном инкубаторе при температуре 37 ^o C и 5% CO ₂ ,

     6. Очистите бокс биобезопасности и верните реагенты/среды в холодильник. 92 колбы для клеточных культур (или чашка Петри на 60 мл для меньших культур).

• ДМСО
• Пробирки для замораживания 2 мл
• Контейнер для замораживания

Шаги:

1. Выполните шаги 1-7 описанной выше процедуры.

2. Приготовьте среду для замораживания.

   1. 5% ДМСО: смешайте 10 мл среды с 0,5 мл ДМСО.

3. Фильтр для замораживания.

   1. Использование шприца для пропускания 5% раствора ДМСО через фильтр.
   2. Полезно использовать пипетку, чтобы поместить раствор в хвостовую часть шприца, соединенного с фильтром, затем вставить поршень и с его помощью протолкнуть раствор.
   3. Не втягивайте поршень после фильтрации, пока фильтр еще прикреплен, так как это приведет к попаданию загрязнений обратно в шприц. Сначала отсоедините фильтр, затем втяните поршень, затем снова подсоедините шприц и фильтр.
4. Охладите среду для замораживания в течение 3-5 минут.

5. Добавьте 7 мл среды к трипсинизированному раствору. Смешивание.

   1. Несколько раз всасывайте раствор в пипетку, а затем распыляйте обратно в колбу, разрушая таким образом цепочки и группы клеток.
6. Разлить в колбу Т-75 в соотношении 1:20 (т.е. взять 0,5 мл вашего 10 мл раствора).

7. К.С. до 25 мл (среда + клеточная суспензия).

   1. Пометьте новую колбу клеточной линией, PD, коэффициентом деления, инициалами и датой.

8. Отцентрифугировать оставшиеся клетки из трипсинизированного раствора.

   1. Раствор трипсина пипеткой внесите в пробирку на 15 мл.
   2. Поместить в центрифугу с противовесом соответствующего размера.
   3. Установите центрифугу на 3 минуты (с центрифугой, которая сейчас находится в комнате для культивирования тканей, переведите таймер на 3 минуты, а затем переместите его назад, иначе центрифуга никогда не остановится).

9. Смешайте клетки с охлажденной средой для замораживания.

   1. Несколько раз всасывайте раствор в пипетку, а затем распыляйте обратно в колбу, разрушая таким образом цепочки и группы клеток.

10. Разделить клеточный раствор на шесть пробирок для замораживания по 2 мл, пометить.