Термекс сервис центр: Ремонт водонагревателей в Нижнем Новгороде и продажа запчастей

Термекс сервис, торгово-сервисный центр водонагревателей в Новокузнецке, проспект Строителей, 3

⭐ Отзывы

Термекс сервис, торгово-сервисный центр водонагревателей по адресу 654006, Кемеровская область, Новокузнецк, проспект Строителей, 3 в дальнейшем Организация, размещена в следующих категориях:

Для связи с организацией воспользуйтесь номером телефона: +7-905-913-55-00, +7-983-222-30-20. Пн: c 09:00-17:00, Вт: c 09:00-17:00, Ср: c 09:00-17:00, Чт: c 09:00-17:00, Пт: c 09:00-17:00, Сб: выходной, Вс: выходной, вы можете обратиться в эту организацию.

Хотим обратить ваше внимание, на то, что у Организации есть сайт http://thermex.ru, поэтому для актуализации контактных данных советуем его посетить. В социальных сетях обычно дублируют информацию с официального сайта, тем не менее, социальные сети это быстрый отклик клиентов и посетителей, вы можете найти ответы на волнующие вас вопросы, советуем также заглянуть и в соц. сети:
https://instagram.com/otoplenie_vodosnabzenie_nkz

Если хотите посетить организацию, советуем вам заранее проложить маршрут. С помощью карты ниже, вы можете узнать точное расстояние, рекомендуемый маршрут, а также загруженность дорог в Новокузнецке.

Карта

Ориентировочное расстояние от центра города до организации 2.6 км.

Отзывы и обсуждение:

К сожалению, отзывов и комментариев нет. Поделитесь своим мнение, будьте первым =)

Как вы оцениваете организацию ?

Минимум символов: 0/50

Возможно вам будут интересны другие организации:

Тел. : +7-906-976-70-06, +7-951-592-77-22
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Орджоникидзе, 21
Режим работы: Пн: c 09:00-19:00, Вт: c 09:00-19:00, Ср: c 09:00-19:00, Чт: c 09:00-19:00, Пт: c 09:00-19:00, Сб: выходной, Вс: выходной. по предварительной записи: пн-пт

Тел.: +7-960-900-48-84
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Октябрьский проспект, 63
Режим работы: Ежедневно с 08:00 до 17:00

Тел.: +7 (3843) 600-106, +7-923-623-11-12
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Орджоникидзе, 21
Режим работы: Пн: c 09:00-19:00, Вт: c 09:00-19:00, Ср: c 09:00-19:00, Чт: c 09:00-19:00, Пт: c 09:00-19:00, Сб: выходной, Вс: выходной

Тел.: +7 (3843) 60-01-06, +7-923-623-11-12
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Орджоникидзе, 21
Режим работы: Пн: c 09:00-19:00, Вт: c 09:00-19:00, Ср: c 09:00-19:00, Чт: c 09:00-19:00, Пт: c 09:00-19:00, Сб: выходной, Вс: выходной

Тел. : +7-913-308-29-17
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Транспортная, 49г
Режим работы: Ежедневно с 09:00 до 18:00

Тел.: +7 (3843) 99-13-43
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Автотранспортная, 14
Режим работы: Пн: c 08:30-17:00, Вт: c 08:30-17:00, Ср: c 08:30-17:00, Чт: c 08:30-17:00, Пт: c 08:30-17:00, Сб: выходной, Вс: выходной

Тел.: +7-923-500-58-92
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, проспект Бардина, 2
Режим работы: Ежедневно с 08:00 до 22:00

Тел.: +7 (3843) 60-54-60, +7-923-637-02-77
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Орджоникидзе, 28а
Режим работы: Ежедневно с 09:00 до 21:00

Тел.: +7-903-940-26-14
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Тореза, 93
Режим работы: Пн: c 09:00-17:00, Вт: c 09:00-17:00, Ср: c 09:00-17:00, Чт: c 09:00-17:00, Пт: c 09:00-17:00, Сб: выходной, Вс: выходной

Тел. : +7-923-631-22-23, +7-913-317-77-78, +7-923-474-44-55
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, ДОЗ, 19/23
Режим работы: Пн: c 09:00-13:00, Вт: c 09:00-13:00, Ср: c 09:00-13:00, Чт: c 09:00-13:00, Пт: c 09:00-13:00, Сб: выходной, Вс: выходной

Тел.: +7 (3843) 910-230, +7 (3843) 77-07-17, +7-961-719-32-32
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, Циолковского, 48а
Режим работы: Пн: c 09:00-17:30, Вт: c 09:00-17:30, Ср: c 09:00-17:30, Чт: c 09:00-17:30, Пт: c 09:00-17:30, Сб: выходной, Вс: выходной

Тел.: +7-951-224-62-19, +7-902-759-59-60
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, ДОЗ, 6
Режим работы: Ежедневно с 09:00 до 21:00. по предварительному звонку: пн-вс

Тел.: +7 (3843) 56-00-01, +7 (3843) 56-00-03, +7-961-700-07-90
Адрес: Кемеровская область, Новокузнецк, ДОЗ, 19/19
Режим работы: Пн: c 08:30-17:00, Вт: c 08:30-17:00, Ср: c 08:30-17:00, Чт: c 08:30-17:00, Пт: c 08:30-17:00, Сб: выходной, Вс: выходной

01. 10.2022 07:15

ТЕРМЕКС-СЕРВИС, Оренбург — Сервисный центр по ремонту водонагревателей на Братьев Коростелёвых проспект, 28а на «Справке РУ» — телефоны, карта, фото, отзывы и оценки клиентов

Сервисный центр по ремонту водонагревателей в Оренбурге

Открыто Сейчас открыто

• QR-код

• Подробнее

Оценка:

Телефон:

• +7 (922) 886-57-71
• +7 (353) 220-93-21

Адрес:

г. Оренбург, Братьев Коростелёвых проспект, 28а 1 этаж

Индекс:

460004

Регион:

Россия, Оренбургская область

Сайт:

• Orenburg. service-centers.ru

Категория:

Ремонтные услуги бытовой техники в Оренбурге

Часы работы:

QR-код с информацией о компании

• Контакты
• Карта
• О компании
• Похожие
• Отзывы

• Скачать PDF
• Распечатать
• Обнаружили ошибку?
• Это ваша компания?

• Карта проезда

• Фотографии

На данный момент не добавлено ни одной фотографии компании.

• О компании

Сервисный центр по ремонту водонагревателей “Термекс-Сервис” работает в сфере ”Ремонтные услуги бытовой техники”. На карте Оренбурга вы можете увидеть улицу и здание по адресу: Оренбург, Братьев Коростелёвых проспект, 28а. . Каждый дозвон по телефону +79228865771 или +73532209321 помогает поддерживать точность и правильность информации о данном предприятии.

• Возможно, вас заинтересует

• Ремонт техники
• Ремонт кофеварок
• Водонагреватели
• Ремонт мясорубок
• Водоснабжение
• Ремонт кофемашины
• Ремонт аудиотехники
• Ремонт плит
• Ремонт микроволновок
• Ремонт холодильника
• Техника-бытовая
• Ремонт бытовых приборов

• Подробнее о виде деятельности

• Дополнительно компания занимается

Способы оплаты

• На месте

  • Наличный расчет

• Дистанционно

  • По счету (для юр. лиц)
  • Картой на нашем сайте

Категории компании

• Продажа бытовой техники в Оренбурге
• Отопительные, канализационные системы, системы водоснабжения в Оренбурге
• Обслуживание отопительных, канализационных систем, водоснабжения в Оренбурге

• Похожие места рядом

Отзывы о Термекс-Сервис

Если вы имеете реальный опыт общения с данной компанией, то просим вас оставить небольшой отзыв: это поможет другим сориентироваться среди 48 компаний в этой сфере.
Огромное спасибо!

Регистрация не требуется

Добавить отзыв

Оренбург Ремонтные услуги бытовой техники в Оренбурге Термекс-Сервис, Сервисный центр по ремонту водонагревателей

Электрический водонагреватель Thermex MS 80 V (pro)

Код товара 1283541

Ссылка скопирована

3.0

2 отзыва

Товар рекомендуют 50%

Смотреть похожие товары

Общие параметры

Основные характеристики

Внутреннее покрытие бака	нерж.сталь
Время нагрева	130 мин
Форма бака	прямоугольная
Способ установки	вертикальный
Подводка	нижняя
Объем бака	80 л
Управление	комбинированное
Максимальная температура нагрева воды	+75 °С
Максимальное давление воды	6. 91 атм
Минимальное давление воды	0.49 атм
Потребляемая мощность	2 кВт (220 В)
Поддерживаемое сетевое напряжение	220 В
Нагревательный элемент	трубчатый
“Сухой” ТЭН	есть
Класс водостойкости	IPX4

Комфорт

Безопасность

Дополнительная информация

Габариты и вес

Размеры (ШхВхГ)	514x1013x306 мм
Вес	16. 8 кг
Ширина	514 мм
Высота	1013 мм
Глубина	306 мм

Комплектация

Гарантия и сертификация

Пока нет ни одного документа для Электрический водонагреватель Thermex MS 80 V (pro)

Покупали у нас этот товар? Поделитесь своим опытом использования товара и получите 1000 бонусов на счет: 500 за текст + 500 за фотографии. Отзывы с фотографиями мы проверяем без очереди и максимально быстро. Подробные правила

Ссылка для написания отзыва доступна вам в Личном кабинете

Сообщить
об ошибке

Информация о товаре носит справочный характер и не является публичной офертой. Характеристики, комплект поставки и внешний вид товара могут отличаться от указанных или быть изменены производителем без предварительного уведомления. Перед покупкой проверяйте информацию на официальном сайте производителя.
Если вы заметили ошибку или неточность в описании товара, пожалуйста, выделите часть текста с ошибкой и нажмите кнопку “Сообщить об ошибке”.

Если вы заметили ошибку или неточность в описании товара, пожалуйста, выделите часть текста с ошибкой и нажмите кнопку “Сообщить об ошибке”.

Оплата картой на сайте без комиссии

и принять условия обработки данных

Спасибо!

Ваше сообщение отправлено

AtmorREGENTTESYATLANTA

Электрические водонагреватели

Газовые водонагреватели

Цена в другом магазине:

Ссылка на товар в другом магазине:

Электронная почта

Ваша заявка отправлена

Повторную заявку вы сможете отправить через:

00 минут

:

00 секунд

Что неправильно?

Как должно быть?

Спасибо!

Ваше сообщение отправлено

Цена в другом магазине:

Ссылка на товар в другом магазине:

Электронная почта

Заголовок

Текст

Гарантия производителя обычно устанавливается на срок один или два года, но для дорогой электроники этого не всегда достаточно.

Приобретение сертификата дополнительной гарантии позволяет:

• 1. учесть негарантийные риски, такие как непроизводственные поломки в результате перепада напряжения, пожара, затопления, кражи, грабежа, разбоя, стихийных бедствий, дополнив возможности гарантии от производителя;
• 2. увеличить срок действия заводской гарантии.

Вы можете самостоятельно выбрать временной промежуток, на который хотите её продлить – это может быть 1, 2 или 3 года.

Почему производитель техники устанавливает гарантию на один, два или в очень редких случаях на три года? Все просто. Чем дольше работает техника, тем выше вероятность поломки. Но вы же не выбрасываете холодильник, стиральную машину или ноутбук сразу после окончания гарантии производителя? Конечно, нет. А что если техника ломается, когда гарантия уже закончилась? Приходится оплачивать ремонт из своего кармана. И часто это большие деньги. Задачу решит сертификат «Дополнительная гарантия».

Длительное размножение гемопоэтических стволовых клеток ex vivo позволяет провести некондиционированную трансплантацию

• Список журналов
• Рукописи авторов HHS
• PMC7006049

Природа. Авторская рукопись; доступно в PMC 2020 7 февраля.

Опубликовано в окончательной редакции как:

Nature. 2019 июль; 571 (7763): 117–121.

Published online 2019 May 29. doi: 10.1038/s41586-019-1244-x

PMCID: PMC7006049

NIHMSID: NIHMS1528318

PMID: 31142833

, ^{1, 2, * †} , ^{3, *} , ³ , ⁴ , ³ , ^{1, 2} , ^{1, 2} , ^{1, 2} , ^{1, 2} , ^{1, 2 , 1, 0028 5 , 4 , 3 , 1, 2, 3, 7 и 3, 6, 7}

^{. Отказ от ответственности}

Дополнительные материалы

Мультипотентные самообновляющиеся гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) регенерируют систему крови взрослых после трансплантации ¹ , лечебная терапия многих заболеваний, таких как иммунодефицит и лейкемия ² . Несмотря на то, что были предприняты значительные усилия для определения факторов поддержания HSC посредством характеристики in vivo костного мозга (BM) HSC микроокружения или ниши ^3–5 , стабильное распространение ex vivo HSC было недостижимым ^6,7 . Здесь мы описываем разработку определенной, свободной от альбумина системы культивирования, которая поддерживает долгосрочное расширение функциональных HSCs. Благодаря систематической оптимизации мы обнаружили, что высокий уровень тромбопоэтина (ТПО) синергизирует с низким уровнем фактора стволовых клеток (SCF) и фибронектина для поддержания самообновления HSC. Кроме того, мы идентифицировали поливиниловый спирт (ПВС) как функционально превосходную, совместимую с Надлежащей производственной практикой (GMP) замену сывороточного альбумина, который долгое время был основным источником биологических загрязнителей в культурах HSC ⁸ . Эти условия обеспечивают от 236 до 899-кратную экспансию функциональных HSC в течение 1 месяца, хотя анализ клонально полученных культур предполагает значительную гетерогенность в способности ex vivo HSC к самообновлению. Используя эту систему, культуры HSC получены всего из 50 клеток, прочно привитых реципиентам без обычной потребности в токсическом предварительном кондиционировании (например, облучении), что предлагает новые подходы к трансплантации HSC. Таким образом, эти результаты имеют важное значение как для фундаментальных исследований HSC, так и для клинической гематологии.

Чтобы оптимизировать культуры HSC, мы сначала титровали ТПО против SCF в 7-дневных культурах CD34 ^– cKit ⁺ Sca1 ⁺ Lin ^– (CD34 ^– KSL) HSC (,), и определили последствия путем конкурентной трансплантации летально облученным мышам-реципиентам против 1×10 ⁶ клеток-конкурентов КМ. Самый высокий 16-недельный химеризм периферической крови (PB) (~30%) наблюдался при 100 нг/мл ТПО и 10 нг/мл SCF (1), возможно, из-за повышенной интернализации cKit при более высоких концентрациях SCF, что вызывало потерю чувствительности к SCF ( ,).

Открыто в отдельном окне

Высокий уровень ТПО синергизирует с низким уровнем SCF и фибронектином для усиления размножения HSC

(a) Средний 16-недельный химеризм донорских PB из 50 CD34 ^– KSL HSC после 7-дневного культивирования в мышиный TPO (1–100 нг/мл) и мышиный SCF (1–100 нг/мл), как описано в . Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ конкурентов BM.

(b) Номер клетки, производный от 50 CD34 ^– KSL, 50 CD150 ⁺ CD34 ^– KSL, 50 CD150 ^– CD34 ^– KSL CD34 ⁺ KSL или 50 сKit ⁺ Sca1 ^– Lin ^– /мл 10028 клеток ВМ после 10 нг/мл 7-дневной культуры в 7-дневной культуре мл SCF. Статистическая значимость рассчитана с использованием ANOVA. *** обозначает р=0,004, а **** обозначает р<0,0001. Среднее значение ± стандартное отклонение из 4 независимых культур.

(c) 28-дневный рост 50 CD34 ^– KSL HSC в 100 нг/мл ТПО и 10 нг/мл SCF, а также с половинной или полной сменой среды (МС) каждые 3 дня. Среднее значение ± стандартное отклонение из 4 независимых культур.

(d) Химеризм донорских PB у мышей-реципиентов из 1×10 ⁴ клеток, полученных из HSC (~1 исходный эквивалент HSC; ~1 HSCeq) после 28-дневного культивирования (начиная с 50 CD34 ^– KSL), как описано в ( c ). Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ конкурентов BM. Донорский химеризм PB на 4–24 неделе у первичных реципиентов ( слева ) и на 4–12 неделе у вторичных реципиентов ( справа ).

(e) 16-недельный донорский PB химеризм от 1×10 ⁴ Клетки, происходящие из HSC (1,25 HSCeq), после 28-дневного культивирования (начиная с 50 CD34 ^– KSL) на пластиковых (n=5) или фибронектиновых (n=3) чашках, культивированных в 100 нг/мл ТПО и 10 нг/мл SCF с полной заменой среды. Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ конкурентов BM. Каждый столбец представляет отдельную мышь. Статистическая значимость рассчитана с использованием непарного двустороннего t-критерия. **** означает p<0,0001.

Условия 100 нг/мл TPO и 10 нг/мл SCF преимущественно индуцировали пролиферацию CD150, полученного из костного мозга ⁺ CD34 ^– KSL HSCs, а не происходящие из костного мозга CD34 ⁺ KSL гемопоэтические клетки-предшественники (HPCs) (). Поэтому мы определили, возможно ли долгосрочное размножение ex vivo HSC, попытавшись культивировать в течение 1 месяца. Поскольку 50 исходных HSC размножались примерно в 13 000 раз во время культивирования (), мы трансплантировали 1×10 ⁴ клеток на реципиента, примерно 1/50 ^th культуры или ~1 исходный эквивалент HSC (называемый ~1 HSCeq). Используя изменения половинной среды, мы обнаружили только кратковременное восстановление (). Однако, выполняя полную замену среды в культурах HSC, мы добились сходного клеточного размножения, но также поддерживали долгосрочную активность HSC от ~ 1 HSCeq (1×10 ⁴ ячеек) (,).

Учитывая необходимость полной смены среды во время культивирования, мы предположили, что прикрепление HSC-планшета может помочь сохранить HSC во время смены среды. Из 5 протестированных покрытий пластин фибронектин больше всего улучшал 16-недельный химеризм PB (). Хотя пролиферация HSC была сходной с фибронектином (), 1×10 ⁴ клеток (1,25 HSCeq) из культур фибронектина на 28-й день давали почти 100% химеризм PB через 16 недель (). Это согласуется с недавними предположениями о том, что фибронектин является нишевым фактором BM 9.0027 9 и передача сигналов фибронектином улучшает поддержание HSC ^10,11 .

Подобно культурам человеческих гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников (HSPC) ¹² , несколько цитокинов и хемокинов (например, IL-6 и Ccl2–4) были в изобилии в культурах 14-дневных культур (, ) и предположили механизмы контаминации HPC (только 3 нг/мл IL-6 усиленный ex vivo CD34 ⁺ KSL HPC пролиферация; ). Профиль секреции также предполагает активацию врожденного иммунного ответа ¹³ . В соответствии с этой идеей, секреция цитокинов снижалась при использовании TLR4 ^-/- HSC или при добавлении дексаметазона (,). Кондиционированные среды также индуцировали потерю активности HSC, предполагая, что факторы, индуцирующие дифференцировку, были растворимыми (1).

Открыть в отдельном окне

Поливиниловый спирт может заменить сывороточный альбумин для размножения HSC ex vivo

(a) Тепловая карта, показывающая кратность изменения средней интенсивности флуоресценции (MFI) иммуноанализа цитокинов с использованием кондиционированных сред с 7-го и 14-го дня культуры ГСК. Среднее значение для 4 независимых культур с кратностью изменения по сравнению с некондиционированной средой.

(b) Клеточная экспансия 50 CD34 ^– KSL HSC после семидневного культивирования в условиях, не содержащих сывороточный альбумин, с добавлением различных потенциальных заменителей сывороточного альбумина с определенным химическим составом (подробности см. в разделе «Методы»). Рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин (HSA) использовали в качестве положительного контроля. Среднее значение ± стандартное отклонение из 3 независимых культур. ND означает не обнаружено.

(c) Средний химеризм донорских PB у первичных реципиентов (n=5 на группу) и вторичных реципиентов (n=4 на группу) от 50 CD34 ^– ГСК KSL после 7-дневного культивирования в средах на основе HSA или PVA, дополненных 100 нг/мл TPO и 10 нг/мл SCF в чашках с U-образным дном. Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ конкурентов BM первичным реципиентам. Статистическая значимость рассчитана с использованием ANOVA. **** означает p<0,0001, н.с. означает статистически незначимое.

(d) 7-дневная экспансия 50 CD150 ⁺ CD34 ^– ГСК KSL в среде, содержащей 87%-гидролизованный ПВС (87%-ПВС) или >99%-гидролизованный ПВС (99%-ПВС). Среднее значение ± стандартное отклонение из 3 независимых культур. Статистическая значимость рассчитана с использованием t-критерия. *** обозначает р=0,0021.

(e) 16-недельный химеризм донорских ФБ из 1×10 ⁴ клеток из 28-дневных культур 87%-ПВС (n=3) и 99%-ПВС (n=4) (см. 28-дневные количество клеток). Каждый столбец представляет отдельную мышь.

(f) 7-дневная экспансия 50 CD34, полученных из пуповинной крови человека ⁺ CD38 ^– CD90 ⁺ CD49f ⁺ HSC в культурах на основе HSA или PVA с добавлением 10 нг/мл человеческого SCF и 100 нг/мл ТПО человека. Среднее значение ± стандартное отклонение из 3 независимых культур.

(g) Средний 16-недельный химеризм CD45 человека ⁺ PB у сублетально облученных мышей NOG (n=5 в группе) после трансплантации 7-дневных культур, полученных из 2×10 ³ CD34 ⁺ клеток . Статистическая значимость рассчитана с использованием ANOVA. ** обозначает р=0,0098. нс означает статистически незначимое.

В наших культурах HSC использовался полученный из дрожжей рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин (HSA). Мы предположили, что рекомбинантные белковые примеси могут быть ответственны за воспалительный фенотип 9.0027 14,15 и искал замену HSA. Сывороточный альбумин может иметь несколько возможных функций в культурах HSC, в том числе как «молекула-носитель» или как источник аминокислот. Поскольку HSC не растут в средах с низким содержанием аминокислот, содержащих альбумин ^16,17 , мы сосредоточились на замене функции молекулы-носителя. Из 11 проверенных химически синтезированных потенциальных заменителей (см. Методы для списка химических веществ) только поливиниловый спирт (ПВС) обеспечивает выживаемость, рост и поддержание фенотипа ГСК (, ). Кроме того, HSC, культивированные PVA, превосходили HSC, культивируемые HSA, в конкурентных тестах на трансплантацию. Мы также наблюдали значительно более низкие концентрации секретируемых факторов в ПВА-культурах (). Экспрессия генов, ассоциированная со старением ^18,19 ( p16Ink4a , p19Arf и Trp53 ) также восстанавливался в ПВС-культурах, а накопление фосфорилирования гамма-гистонов 2А.Х ²⁰ не определялось (,). В соответствии с ролью TLR4 в фенотипе HSA, добавление липополисахарида TLR4-агониста к PVA-культурам вызывало аналогичную индукцию p16 и p19 , а также секрецию IL-6 ().

В то время как ПВА использовался для культивирования эмбриональных клеток 9 типов0027 21,22 , его механистическая роль до сих пор плохо изучена. Чтобы исследовать свойства ПВС, которые позволяют ему действовать как заменитель альбумина, мы сравнили состояния гидролиза ПВС. В нашем первоначальном скрининге использовался 87%-ный гидролизованный ПВС (87%-ПВС), амфифильный полимер, содержащий домены ацетата и спирта. Напротив, в >99%-гидролизованном ПВС (99%-ПВС) отсутствуют ацетатные домены. ГСК выживали в средах, содержащих любой ПВС, но пролиферация была в 5 раз меньше в культурах с 99% ПВС (, ). Однако конкурентная трансплантация 1×10 ⁴ клеток из культур 87%-PVA и 99%-PVA на 28-й день продемонстрировали, что оба типа PVA поддерживали HSC ex vivo ().

Являясь недорогой, но совместимой с GMP заменой альбумина, ПВА также может иметь важное значение для размножения ГСК человека. В качестве подтверждения концепции мы подтвердили, что ПВА может заменить сывороточный альбумин в культурах CD34 ⁺ HSPC, полученных из пуповинной крови человека (). Однако человеческий CD34 ⁺ CD38 ^– CD90 ⁺ CD49f ⁺ HSC пролиферировали сходным образом в 87%-PVA и 99%-PVA (), что свидетельствует о том, что в отличие от мыши пролиферация HSC человека не чувствительна к амфифильному PVA. Оба типа PVA могут поддерживать функциональную активность HSC ex vivo ().

Исходя из приведенных выше результатов, мы определили оптимальные условия культивирования HSC мыши как 100 нг/мл TPO, 10 нг/мл SCF и 87%-PVA на фибронектине (). В этих условиях 50 CD150 ⁺ CD34 ^– KSL HSC увеличивались примерно в 8000 раз в течение 28 дней (). В анализах предельных разведений (LDA) 28-дневных культур (трансплантированных против 2×10 ⁵ конкурентов BM), только 50 аликвот клеток демонстрировали >1% многолинейного химеризма PB через 16 недель у 2 из 3 реципиентов (,). С помощью анализа предельного разведения ²³ мы рассчитали частоту HSC при 1:34,3 клеток, что эквивалентно 1,2×10 ⁴ функциональных HSC в 28-дневной культуре (). Это сопоставимо с частотой 1:3,8 функциональных ГСК в свежеизолированной популяции CD150 ⁺ CD34 ^– KSL (на основе данных о предыдущих трансплантациях ²⁴ ). Таким образом, мы оцениваем расширение функциональных HSCs между 236-кратным (при условии, что все 50 исходных клеток были функциональными HSC) и 899-кратным (при условии, что исходные клетки 1: 3,8 [~ 13 клеток] были функциональными HSC).

Открыть в отдельном окне

Длительное размножение функциональных ГСК ex vivo

(а) Схема оптимизированной культуры размножения ГСК мыши: 50 CD150 ⁺ CD34 ^– нижние лунки планшета, покрытые фибронектином, содержащие среду F12, не содержащую альбумина, с добавлением 1 мг/мл ПВС, 100 нг/мл ТПО и 10 нг/мл SCF.

(b) Среднее количество живых клеток после культивирования 50 CD150 ⁺ CD34 ^– ГСК KSL в течение 28 дней (n=6) или 57 дней (n=3) на планшетах, покрытых фибронектином, в культуральной среде на основе ПВС . Столбики погрешностей обозначают sd.

(c) Блочные диаграммы, представляющие анализ предельных разведений свежих CD150 ⁺ CD34 ^– KSL (всего 138 мышей; опубликовано ранее ^24,25 ) и 28-дневных культур HSC (всего 16 мышей; см.) рассчитано с помощью программного обеспечения ELDA ²³ с использованием положительного порогового значения >1% многолинейного химеризма PB через 16 недель. Прямоугольные диаграммы обозначают рассчитанное среднее значение, а также верхний и нижний пределы.

(d) 12-недельный донорский PB-химеризм у мышей-вторичных реципиентов (n=5 на группу), из 100 и 50 донорских клеток из культур PVA на 28-й день (с использованием первичных реципиентов в ). BM от трех первичных реципиентов объединяли и 1×10 ⁶ клеток трансплантировали вторичным реципиентам. Каждый столбец представляет отдельную мышь.

(e) Средний процент клеток фенотипической линии ^–, KSL и CD150 ⁺ KSL во время культивирования, как описано в ( a ), на 7-й день (n=4), 14-й день (n=4) , 21-й день (n=4), 28-й день (n=6) и 57-й день (n=3). Столбики погрешностей обозначают sd.

(f) Схема анализа размножения одиночных HSC: одиночные CD150 ⁺ CD34 ^– KSL HSC размножали в течение 28 дней, а затем трансплантировали пяти летально облученным мышам-реципиентам против 5×10 ⁵ BM конкурентов. Отдельные HSC расширились до ~ 5 × 10 ⁵ клеток, что означает, что каждый реципиент получил ~ 1 × 10 ⁵ клеток (0,2 HSCeq). Было пересажено 10 отдельных культур, происходящих из HSC.

(ж) 16-недельный донорский PB-химеризм из 1/5 ^-й 28-дневной культуры, полученной из одного CD150 ⁺ CD34 ^– KSL HSC (n=5), как описано в ( f ). Каждый столбец представляет отдельную мышь. Репрезентативные данные для 3 независимых одиночных культур HSC (из 10 трансплантированных).

Вторичная трансплантация проводилась путем объединения костного мозга от первичных реципиентов LDA (3 дожили до 16 недель): все вторичные реципиенты 10 ⁶ клеток костного мозга из 100-клеточных и 50-клеточных первичных трансплантатов проявляли химеризм донорских PB на 12-й неделе жизни. недели (). Поскольку это были объединенные вторичные трансплантаты, мы можем только заключить, что по крайней мере 1 из 150 клеток на 28-й день были серийно трансплантируемыми долгосрочными HSC. Таким образом, мы оцениваем увеличение серийно приживляемых HSC как минимум в 54 раза (при условии, что все исходные клетки были функциональными HSC) и в 204 раза (при условии, что только 1:3,8 исходных клеток [~ 13 клеток] были функциональными HSC).

В соответствии с высокой функциональной активностью на 28-й день маркеры старения не увеличивались, а Trp53 оставался без мутаций (,). Популяция KSL также оставалась отрицательной для связанной со старением бета-галактозидазы (, ) . Кроме того, приживление HSC было кариотипически нормальным (). Ex vivo фенотипические популяции KSL оставались довольно стабильными во время культивирования (, ), и большинство клеток в культурах оставались клон-отрицательными (на основе смеси клонов антител Ly-6G/Ly-6C/Ter119/CD45RA/CD4/CD8/CD127; ). Коктейль-положительные клетки линии были Ly-6G/Ly-6C ⁺ , хотя дополнительный анализ идентифицировал клетки FceR1 ⁺ с аналогичными частотами (). Культивирование HSC также можно было продолжать в течение более длительного времени: к 57-му дню культивирования 50 начальных HSC образовали ~7,3×10 ⁶ клеток, сохраняя при этом стабильную фенотипическую популяцию KSL и функциональную активность HSC (,; ).

Хотя HSC BM мыши могут быть высокообогащенными на основании экспрессии поверхностных маркеров, очищенные клетки CD150 ⁺ CD34 ^– KSL демонстрируют значительную функциональную гетерогенность в тестах на трансплантацию отдельных клеток ^24,25 . В соответствии с этим наблюдалась значительная изменчивость в размножении одиночных HSC, при этом некоторые клетки генерировали только <100 клеток, в то время как другие размножались до ~ 5×10 ⁵ клеток (хотя > 90% образовывали колонии; ). Наиболее пролиферативные клоны генерировали такое же количество клеток, как и культуры из 50 или 500 HSC (1), что указывает на ограниченный рост по площади поверхности. Фенотипическая гетерогенность также наблюдалась в культурах клонального происхождения; некоторые клоны сохранили ~ 90% KSL (), в то время как другие почти исключительно генерировали cKit ⁺ Sca1 ^– Lin ^– кл. Трансплантация клональных культур привела к высокому уровню мультипотентной активности у 4 из 14 реципиентов (1). Мы также обнаружили надежный (~ 15%) химеризм PB, когда культуры клонального происхождения были разделены и трансплантированы 5 реципиентам против 5×10 ⁵ конкурентов BM (для 3 из 10 протестированных одиночных культур HSC; ,). Эти эксперименты подтвердили bona fide самообновление HSC ex vivo , но предположили, что способность к самообновлению неравномерно распределена внутри фенотипического компартмента HSC.

Кондиционирование костного мозга на основе радиации обычно требуется, чтобы освободить место для донорских ГСК при трансплантации ГСК. Приживление донорского трансплантата у некондиционированных реципиентов возможно, но обычно невозможно, поскольку для трансплантации требуется очень большое количество HSC ^26,27 . Размножая 50 HSC за 28 дней до трансплантации, мы смогли добиться долгосрочного химеризма донорских PB и BM HSC у некондиционированных иммунокомпетентных мышей (-). Этот подход можно также использовать для прививки иммунодефицитных мышей NOD/SCID, модели врожденного иммунодефицита; мультилинейный химеризм ПВ наблюдался у всех реципиентов с донорскими лимфоидными В- и Т-клетками, обнаруженными в долгосрочной перспективе (-).

Открыть в отдельном окне

Расширенные ГСК ex vivo приживаются у некондиционированных реципиентов

(а) Схема некондиционированной аутологичной трансплантации: 50 CD150 ⁺ CD34 ^– клеток KSL из C57BL/C57BL/KSL6 Мышей CD45. 1 размножали в течение 28 дней перед трансплантацией некондиционированным реципиентам C57BL/6-CD45.1/CD45.2.

(b) Средний 4–16-недельный химеризм донорских PB из 50 свежих HSC (n = 5) или 28-дневной культуры, полученной из 50 HSC (50 HSCeq; n = 5), трансплантированных, как описано в ( и ).

(c) Средний 16-недельный донорский BM CD34 ^– Химеризм KSL HSC (n = 5) для анализа, описанного в ( a ) ( слева ), и пример графика проточной цитометрии, отображающего CD45.1 и CD45 .2 экспрессия в компартменте BM CD34 ^– KSL мышей-реципиентов ( справа ).

(d) Графическая сводка оптимизированных условий для размножения функциональных мышиных HSC.

Таким образом, мы разработали не содержащий альбумина ex vivo условия культуры, которые расширяют функциональные HSC мыши () с широким применением в исследованиях HSC. Хотя нам удавалось изолировать HSC высокой степени чистоты в течение более 20 лет ¹ , стабильное размножение функциональных HSC ex vivo оставалось неуловимым. Наши результаты показывают, что плохая оптимизация существующих компонентов культуры в сочетании с примесями добавок к средам была основным препятствием для распространения ex vivo HSC.

Отчетность по данным.

Статистические методы не использовались для предварительного определения размера выборки. Эксперименты не были рандомизированы, и исследователи не были слепы к оценке результатов.

Мыши.

Мыши C57BL/6-CD45.2 и C57BL/6-CD45.1 (PepboyJ) были приобретены у Japan SLC, Sankyo-Lab Service, Jackson Laboratories (000664, 002014) или выведены собственными силами. Для экспериментов по конгенной трансплантации в качестве доноров использовали мышей-самцов в возрасте 8–12 недель, а в качестве реципиентов — мышей-самок в возрасте 8–12 недель. Мыши с нокаутом TLR2, мыши с нокаутом по TLR4 и мыши NOD/Scid (NOD.Cg-Prkdc ^scid ) были приобретены у Jackson Laboratories (004650, 007227, 005557 и 001303 соответственно). NG (NOD.Cg-Prkdc 9Мышей 0027 scid Il-2rγ ^null /SzJ) приобретали у In Vivo Science Inc. Всех мышей содержали в условиях, свободных от конкретных патогенов (SPF), со свободным доступом к пище и воде. Все протоколы животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Института медицинских наук Токийского университета, Комитетом по уходу и использованию животных филиала RIKEN Tsukuba и/или Административной комиссией по уходу за лабораторными животными Стэнфордского университета.

Сбор клеток методом флуоресцентной сортировки клеток (FACS).

Клетки костного мозга мыши выделяли из большеберцовой кости, бедренной кости и таза, окрашивали антителами APC-cKit и cKit-позитивными клетками, обогащенными с использованием магнитных шариков против APC и колонок LS (Miltenyi Biotec). Обогащенные cKit клетки окрашивали коктейлем клональных антител (биотинилированные-CD4, -CD8, -CD45RA/B220, -TER119, -Gr1 и -CD127), а затем окрашивали анти-CD34, анти-cKit, анти- Sca1 и стрептавидин-APC/eFluor 780 (как подробно описано в ) в течение 90 минут. Там, где указано, клетки также окрашивали анти-CD150. Затем клеточные популяции очищали с использованием FACS AriaII (BD) путем прямой сортировки в лунки, содержащие среды, с использованием PI в качестве красителя живой/мертвый ().

Культуры клеток мышей на основе сывороточного альбумина.

Посев на основе сывороточного альбумина проводили с использованием среды F12 (Life Technologies), 1% инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSX; Life Technologies), 1% пенициллин/стрептомицин/глутамин (P/S/G; Life Technologies) , 10 мМ HEPES (Life Technologies), 0,1% рекомбинантный сывороточный альбумин человека (HSA; Albumin Biosciences), при 37°C с 5% CO ₂ . Культуры были дополнены рекомбинантным мышиным SCF и рекомбинантным мышиным TPO (Peprotech), как указано. Во всех долговременных культурах использовали 10 нг/мл SCF и 100 нг/мл TPO, при этом смена среды производилась каждые 3 дня после первых 5 дней путем ручного удаления кондиционированной среды путем пипетирования и замены свежей среды, как указано. В 96-луночных лунок планшета, содержащих 200 мкл среды, это включало осторожное удаление 190–200 мкл кондиционированной среды с помощью пипетки, чтобы не повредить клетки, которые были слегка прилипли к дну лунки, а затем аккуратное пипетирование 200 мкл пре- подогретую и свежеприготовленную среду вниз по стенке лунки, чтобы свести к минимуму нарушение клеточного слоя. Любые клетки, удаленные из лунки в кондиционированной среде, отбрасывали. Длительное культивирование проводили с использованием планшетов с плоским дном, обработанных культурой ткани и/или покрытых фибронектином (Corning; 354409).), коллаген1 (Corning; 354407), коллаген4 (Corning; 354429), желатин (Sigma; G2500) или ламинин511 (iMatrix; 8

). Где указано, к культурам добавляли различные концентрации рекомбинантного мышиного IL-6 (Peprotech).

Культуры клеток мыши, не содержащие сывороточный альбумин.

HSC культивировали в среде, состоящей из среды F12, 1% ITSX, 1%, 10 мМ HEPES, 1% P/S/G, 100 нг/мл мышиного TPO, 10 нг/мл мышиного SCF и 0,1% следующие химические вещества (все от Sigma): гидроксипропилцеллюлоза (HPC; 435007), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы низкой вязкости (CMC-LV; C5678), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы средней вязкости (CMC-MV; 21902), альфа-циклодекстрин (альфа-CD; C4642), бета-циклодекстрин (бета-CD; C4767), гамма-циклодекстрин (гамма-CD; C4930), 2-гидроксипропил-бетал-циклодекстрин (HBC; h207), 2 -гидроксипропил-гамма-циклодекстрин (HGC; h225), метил-бета-циклодекстрин (MBC; C4555), полоксамер 188 (polox188; P5556) или поливиниловый спирт (PVA; P8136, 363081 или 363146) при 37°C с 5% CO ₂ . Для долговременных культур в культурах на основе ПВС полная замена среды производилась каждые 2–3 дня после первых 5–6 дней, как описано выше для культур на основе альбумина. Долгосрочные культуры делили 1:3 при ~90% слияние. Где указано, к культурам добавляли липополисахарид (LPS; Sigma L2762) или IL-6 (Peprotech).

Анализ культивируемых клеток.

После культивирования ex vivo клетки подсчитывали (с использованием гемоцитометра, цитометра CYTORECON или Nucleocounter NC-3000). Для проточного цитометрического анализа клетки окрашивали коктейлем клонов (биотинилированные CD4, -CD8, -CD45RA/B220, -TER119, -Gr-1 и -CD127), а затем детализировали антителами в течение 30–90 минут. После этапа промывки был проведен проточный цитометрический анализ с использованием FACS AriaII (BD), LSRFortessa (BD) или FACS Canto (BD) с использованием PI в качестве живого/мертвого красителя.

Анализ конкурентной трансплантации.

Культуральные HSC от мышей C57BL/6-CD45. 1 были трансплантированы вместе с 1×10 ⁶ целых клеток-конкурентов костного мозга C57BL/6-CD45.1/CD45.1 (F1) мышей C57BL/6-CD45.2 после облучения в летальной дозе (9,5 Гр). Донорский химеризм отслеживали путем сбора клеток периферической крови (PB) и окрашивания анти-CD45.1, анти-CD45.2, анти-CD11b, анти-Ly-6G/Ly-6C, анти-CD45RA (B220), анти- CD4, анти-CD8 антитела (подробно) в течение 30 минут. После этапа промывки клетки анализировали с помощью проточной цитометрии (как указано выше), используя PI в качестве красителя живой/мертвый. Анализ вторичной трансплантации костного мозга проводили путем переноса 1×10 ⁶ Клетки BM от первичных мышей-реципиентов в летально облученных мышей C57BL/6-CD45.2 с анализом донорского химеризма, как указано выше.

Анализ с предельным разведением.

Для анализа предельных разведений установленное количество культивируемых клеток C57BL/6-CD45.1 после культивирования разделяли на аликвоты с помощью FACS и трансплантировали летально облученным мышам-реципиентам C57BL/6-CD45. 2 вместе с 2×10 ⁵ F1 BM клетки-конкуренты. Донорный химеризм анализировали, как описано выше. Анализ предельных разведений проводили с использованием программного обеспечения ELDA ²³ , на основе 1% химеризма PB мультилинии (по крайней мере, 0,2% миелоидного донорского химеризма) в качестве порога для положительного приживления. Для расчета частоты свежих HSC те же критерии были применены в общей сложности к 138 анализам трансплантации из свежеизолированных CD150 ⁺ CD34 ^– клеток KSL, которые мы опубликовали ранее ^24,25 . Там, где это указано, анализы вторичной трансплантации проводили, как описано выше.

Анализы некондиционированных трансплантатов.

CD150 ⁺ CD34 ^– Клетки KSL очищали от мышей C57BL/6-CD45.1 или C57BL/6-CD45.2 и размножали, как описано выше. Свежевыделенные или размноженные клеточные культуры затем трансплантировали необлученным мышам-реципиентам C57BL/6-CD45.1/CD45. 2 или мышам-реципиентам NOD/SCID (CD45.1), разделенным на три дозы в течение последовательных дней.

Иммуноанализ цитокинов.

Кондиционированные среды собирали на 7-й день (до любой замены среды) или на 14-й день (после смены среды на 10-й день) или как указано в подписях к рисункам. Мышь 39Наборы -plex (eBiosciences) использовали в соответствии с рекомендациями производителя с модификациями, описанными ниже. Вкратце, шарики добавляли в 96-луночный планшет и промывали в промывочной машине Biotek ELx405. Образцы добавляли в планшет, содержащий смешанные шарики, связанные с антителами, и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа с последующей инкубацией в течение ночи при 4°C при встряхивании. Стадии инкубации при холодной и комнатной температуре проводили на орбитальном шейкере при 500–600 об/мин. После инкубации в течение ночи планшеты промывали в промывочной машине Biotek ELx405, а затем добавляли биотинилированные антитела для детекции на 60 минут при комнатной температуре при встряхивании. Планшет промывали, как указано выше, и добавляли стрептавидин-РЕ. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре проводили промывку и добавляли в лунки буфер для считывания. Планшеты считывали с использованием прибора Luminex Flex3D с нижней границей 50 гранул на образец на цитокин. Индивидуальные контрольные шарики (анализ CHEX) от Radix Biosolutions добавляли во все лунки.

Культуры клеток человека и анализы ксенотрансплантатов.

Клетки CD34 ⁺ , полученные из пуповинной крови человека (приобретенные у Lonza или Stem Cell Technologies), или очищенные с помощью FACS CD34 ⁺ CD38 ^– CD90 ⁺ CD49f ⁺ клетки CD49f ^{+ 40028 [Biolegend; 560940], PE-CD38 [BD; 347687], FITC-CD90 [Biolegend; 328113] и APC/Cy7-CD49f [Biolegend; 313611]) культивировали в IMDM (Life Technologies), содержащем 0,1% HSA или 0,1 % PVA (Sigma P8136, 363081 или 363146), дополненный 1% ITSX, 1% P/S/G, 10 мМ HEPES. Для анализа пролиферации 50 клеток высевали на лунку и добавляли 10 нг/мл человеческого SCF и 100 нг/мл человеческого TPO (Peprotech). Во время культивирования среду обновляли каждые три дня и подсчитывали на 7-й день. Для анализа ксенотрансплантата 2×10 9Клетки 0027 3} размножали в течение 7 дней перед внутривенной инъекцией сублетально облученным (1,5 Гр) мышам NOG. Химеризм клеток человека в PB рассчитывали через 16 недель после трансплантации с использованием антител PE/Cy7-CD45.1 (Biolegend; 110730) и V450-hCD45 (BD; 560367).

Анализ старения.

Тотальную РНК клеток KSL экстрагировали с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN) и подвергали обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой нити SuperScript III и праймеров Oligo (dT) (Invitrogen). Количественную ПЦР выполняли на термоциклере Dice Real Time System (Takara) с использованием SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix и следующих наборов праймеров: p16Ink4a (GAACTCTTTCGGTCGTACCC и CGAATCTGCACCGTAGTTGA), p19Arf (GGGTTTTCTTGGTGAAGTTCG и TTGCCCATCATCATCACCT) и Trp53 (CAGTCTACTTCCCGCCATAA и GTCTCAGCCCTGAAGTCATAAG). Условия реакции: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов: 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 72°С в течение 20 с. Экспрессию генов нормализовали относительно экспрессии Gapdh (с использованием набора праймеров: CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC и TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT). Окрашивание бета-галактозидазы Senescence (Cell Signaling, набор 9860S) выполняли в соответствии с инструкциями производителя после прикрепления клеток к планшетам, покрытым поли-L-лизином. Для секвенирования по Сэнгеру кДНК Trp53 амплифицировали с помощью ПЦР (с использованием набора праймеров: CATCCTGGCTGTAGGTAGCG ACCCTATGAGGGCCCAAGAT) и секвенировали с использованием вложенных праймеров для секвенирования: AAAAGTCTGCCTGTCTTCCAG; TGATGGCCTGGCTCCTCC; CACGTACTCTCCTCCCCTCA; и CTTCTGTACGGCGGTCTCTC. Секвенирование по Сэнгеру было передано на аутсорсинг компании FASMAC Co. Ltd, а визуализация и выравнивание выполнялись с помощью программного обеспечения SnapGene.

Флуоресцентное иммуноокрашивание фосфопротеинов.



Флуоресцентное иммуноокрашивание выполняли путем прикрепления, фиксации и окрашивания клеток на предметных стеклах, покрытых поли-1-лизином (Matsunami Glass, Осака, Япония), с визуализацией и количественным определением, выполненным с помощью считывающего устройства Cellomics ArrayScan VTI HCS (ThermoScientific), с использованием методы, описанные ранее ^20,28 .

Кариотипический анализ.

Кариотипирование проводили на клетках ВМ CD45.1 ⁺ , очищенных с помощью FACS от первичных реципиентов 28-дневных ПВС-культивируемых HSC через 16 недель после трансплантации, и проводили Nihon Gene Research Laboratories Inc. (Япония).

Статистический анализ.

Односторонний и двусторонний тесты ANOVA и непарные двусторонние t-тесты были выполнены, как показано на рисунках, с использованием программного обеспечения Prism 7.

Расширенные данные Рисунок 1:

Открыть в отдельном окне

Оптимизация условий для долгосрочного культивирования HSC

(a) Схема стандартного анализа культивирования HSC: C57BL/6-CD45. 1 BM CD34 ^– cKit ⁺ Sca1 ⁺ Lineage ^– (CD34 ^– KSL) HSC сортировали (50 клеток/лунка) в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном, см. (b ) схему сортировки. Рост HSC можно наблюдать во время культивирования с помощью подсчета или проточной цитометрии со сменой среды каждые три дня (после первых семи дней культивирования). Через 7–28 дней определяли функциональную активность ГСК с помощью конкурентной трансплантации облученным мышам C57BL/6-CD45.2 против 1×10 ⁶ клеток-конкурентов КМ из C57BL/6-CD45.1/CD45.2 (F1). мышей. Донорский химеризм в миелоидных, Т- и В-клеточных линиях периферической крови (PB) определялся через 4–16 недель или дольше. Там, где это указано, анализы вторичной трансплантации проводили путем трансплантации 10 ⁶ Клетки костного мозга от первичных реципиентов в облученных мышах C57BL/6-CD45.2.

(b) Стратегия гейтирования FACS для сортировки клеток CD34 ^– KSL (вороты 1–7) и клеток CD150 ⁺ CD34 ^– KSL (вороты 1–8) из мышиного BM, обогащенного cKit. Представитель не менее 5 экспериментов.

(c) Гистограммы проточной цитометрии для окрашивания cKit клеточной поверхности HSC после стимуляции 100 нг/мл TPO и 0, 10 или 100 нг/мл SCF в течение 1, 24 и 48 часов. Представитель 3 независимых культур.

(d) Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) окрашивания антител cKit на ГСК, культивированных в 100 нг/мл ТПО с добавлением 10 нг/мл или 100 нг/мл SCF, проанализированная через 1–72 часа в культуре, по сравнению с культурами, содержащими 100 нг/мл ТПО без SCF. Среднее из 3 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd.

(e) Средний 16-недельный химеризм донорских PB из 1×10 ⁴ Клетки, полученные из HSC, после 28-дневного культивирования на пластике (n=5), коллагене1 (n=3), коллагене4 (n=4) , Fibronectin (n=3), Gelatin (n=5) или Laminin511 (n=4) культуральные чашки (культивирование в 100 нг/мл TPO и 10 нг/мл SCF с полной заменой среды). Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ Конкуренты БМ.

(f) Количество живых клеток после культивирования 50 CD34 ^– KSL HSC в течение 28 дней на пластиковых (обработанных тканевой культурой) чашках или чашках, покрытых фибронектином. Среднее из 3 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd.

Расширенные данные Рисунок 2:

Открыть в отдельном окне

Идентификация условий культивирования HSC на основе PVA

(a) Кратность изменения средней интенсивности флуоресценции (MFI) по результатам иммуноанализа цитокинов, проведенного на HSC на основе HSA культуры между 8-м и 13-м днем. Смену среды проводили на 7-й и 10-й день. Среднее значение для 4 независимых культур с кратной заменой по сравнению с некондиционированной средой. Столбики погрешностей обозначают sd.

(b) Средняя 7-дневная экспансия 50 CD34 ⁺ KSL HPC в 100 нг/мл ТПО и 10 нг/мл SCF с добавлением или без добавления 0,3 нг/мл-10 нг/мл мышиного IL-6 (n =4).

(c) Тепловая карта, отображающая кратное изменение MFI по результатам иммуноанализа цитокинов с использованием кондиционированных сред из культур HSC 14-го дня. CD34 ^– KSL HSC выделяли из мышей C57BL/6 WT, TLR2-KO или TLR4-KO и культивировали в культурах на основе HSA. Там, где указано, добавляли дексаметазон (+Dex) в концентрации 50 нМ. Среднее значение для 4 независимых культур с кратностью изменения по сравнению с некондиционированной средой.

(d) Концентрация IL-6, наблюдаемая в 14-дневных культурах HSC WT на основе HSA (n = 8), HSC TLR2-KO (n = 8), HSC TLR4-KO (n = 6) или WT ГСК +Dex (n=8). Столбики погрешностей обозначают sd.

(e) Средний 12-недельный химеризм донорских PB из 7-дневных культивируемых HSC в свежей среде (n = 7) или в среде, состоящей из 50% среды, полученной из 12-дневной культуры HSC, и 50% свежей среды (называемой кондиционированные среды; n=7). Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ конкурентов BM.

(f) Пример графиков проточной цитометрии, показывающих экспрессию cKit и Sca1 на Lin ^– потомство ( слева ) и экспрессия CD150 и CD48 в популяции KSL ( справа ) после семидневной культуры HSC на основе поливинилового спирта (ПВС). Представитель 4 независимых культур.

(g) Концентрация различных цитокинов в кондиционированных средах на 14-й день из культур CD34 на основе HSA или PVA ^– KSL HSC. Среднее из 8 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-тестов. *, **, *** и **** обозначают р<0,05, р<0,01, р<0,001 и р<0,0001 соответственно.

(h) Относительная экспрессия p16Ink4a , p19Arf и p53 в клетках KSL, собранных из 14-дневных культур (культуры на основе HSA с половинной сменой среды, культуры на основе HSA с полной сменой среды и Культуры на основе ПВС с полной заменой среды) по сравнению с экспрессией в свежевыделенных клетках KSL. Среднее значение для 3 независимых культур с экспрессией генов, нормализованной до экспрессии Gapdh . Столбики погрешностей обозначают sd.

(i) Количество ядерных очагов фосфо-гамма-гистонов 2AX (h3AX) в клетках KSL на 28-й день из культур HSC на основе HSA или PVA. Облученные клетки включали в качестве положительного контроля. 49количество клеток в зависимости от состояния.

(j) Относительная экспрессия p16Ink4a , p19Arf и p53 в клетках KSL, собранных из 14-дневных культур ( оставил ): культуры на основе HSA, культуры на основе PVA и культуры на основе PVA с добавлением 1 нг/мл LPS. Среднее значение технических четверок с экспрессией генов, нормализованной к экспрессии Gapdh . Концентрацию IL-6 наблюдают в этих условиях культивирования ( справа ). Среднее из 4 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd.

(k) 28-дневная экспансия 50 CD150 ⁺ CD34 ^– HSC KSL в среде, содержащей 87% гидролизованного ПВС (87%-ПВС) или >99% гидролизованного ПВС (99%-ПВС). 1×10 ⁴ клеток на 28-й день представляет ~1 HSCeq для 87%-PVA и ~5 HSCeq для 99%-PVA. Среднее из 3 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd.

(l) 7-дневная экспансия 50 клеток CB CD34 ⁺ человека в культурах на основе HSA или PVA, дополненных 10 нг/мл SCF человека и 100 нг/мл TPO человека. Среднее из 3 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd.

Расширенные данные Рисунок 3:

Открыть в отдельном окне

Характеристика долгосрочных культур HSC на основе ПВА

CD150 ⁺ CD34 ^– KSL) Культуры HSC с использованием 100 нг/мл TPO и 10 нг/мл SCF в лунках, покрытых фибронектином, с полной заменой среды. Указанные числа клеток трансплантированы против 2×10 ⁵ клеток ВМ. Данные двух независимых экспериментов по трансплантации.

(b) 16-недельный многолинейный химеризм PB донора для каждой отдельной мыши в ( a ).

(c) Экспрессия p16Ink4a , p19Arf и p53 в 28-дневных PVA-культивируемых клетках KSL по сравнению с экспрессией в свежевыделенных клетках KSL. Среднее значение для 3 независимых культур с экспрессией генов, нормализованной до экспрессии Gapdh . Столбики погрешностей обозначают sd.

(d) След секвенирования по Сэнгеру кДНК p53 , амплифицированной из клеток KSL, собранных из 28-дневных культур HSC на основе PVA (n = 1).

(e) Репрезентативные изображения окрашивания активности бета-галактозидазы свежевыделенного KSL, KSL, выделенного из 28-дневных культур на основе ПВС, и нерасфасованных 28-дневных культур на основе ПВС. Представитель двух биологических повторностей.

(f) Процент клеток, положительных по бета-галактозидазе, в условиях, описанных в ( и ). Среднее значение технических трехкратных повторов (50–100 клеток, подсчитанных на повтор). Столбики погрешностей обозначают стандартное отклонение; ND означает не обнаружено.

(г) Кариотип CD45.1 ⁺ BM-репопуляционное потомство размноженных на 28-й день функциональных HSC в среде на основе PVA через 16 недель после трансплантации. Все проанализированные хромосомы были нормальными в 25 из 25 проанализированных клеток (выполнено Nihon Gene Research Laboratories Inc. ).

(h) Частота CD11A ⁺ , CD34 ⁺ , CD48 ⁺ , CD135 ⁺ , CD201 ⁺ и ESAM ⁺ Clustry Wither Fenophic Populs KSL в течение и ESAM ⁺ Clustry Liding Fenophic Populs KSL во время eSAM ⁺ в рамках фенотипической популяции KSL в течение и ESAM ⁺ в рамках фенотипической популяции KSL в течение и ESAM ⁺ . (получено из 50 CD150 ⁺ CD34 ^– КСЛ). Среднее из 4 независимых культур. Столбики погрешностей обозначают sd.

(i) Состав положительного по маркеру линии компартмента 28-дневных культур HSC. Коктейль антител линии происхождения, использованный в этом исследовании, состоял из CD4, CD8, CD45RA, Ter119, Ly-6C/Ly-6G и CD127. В культуре также была идентифицирована неперекрывающаяся популяция клеток FceR1 ⁺ , и ее количественно определяли относительно положительной популяции клеток линии антитело-коктейль. Среднее из 4 независимых культур. Планки погрешностей, обозначающие sd.

(j) Средний 4-16-недельный химеризм донорских PB из 1×10 ⁵ клеток из 57-дневной культуры HSC на основе PVA с использованием планшетов, покрытых фибронектином, и с добавлением 100 нг/мл TPO и 10 нг/мл SCF (п=5). Конкурентная трансплантация против 1×10 ⁶ конкурентов BM.

Расширенные данные0027 +

Клетки KSL, полученные из одного CD150 ⁺ CD34 ^– ГСК KSL после 28-дневного культивирования (n = 48; осталось ), и среднее количество живых клеток из общей массы (50 и 500) CD150 ⁺ CD34 ^– Культуры KSL HSC через 28 дней (n=4; справа ).

(b) Доля фенотипических типов клеток, составляющих 28-дневные культуры, полученные из одиночных CD150 ⁺ CD34 ^– KSL HSC. Проанализированы только культуры с >10 000 клеток (проанализировано 39 лунок из 84).

(c) 16-недельный донорский PB-химеризм 28-дневной экспансии одиночных CD150 ⁺ CD34 ^– культур HSC KSL, трансплантированных летально облученным реципиентам против 2×10 ⁵ клеток КМ. Каждый столбец представляет отдельную мышь.

(d) 4–12-недельный донорский PB-химеризм из 1/5 ^th 28-дневной культуры, полученной из одной CD150 ⁺ CD34 ^– KSL HSC, как описано в ,. Каждый столбец представляет отдельную мышь. Репрезентативные данные для 3 независимых одиночных культур HSC (из 10 трансплантированных).

Расширенные данные Рисунок 5:

Открыть в отдельном окне

Некондиционированная трансплантация иммунодефицитным реципиентам

(a) Схема некондиционированной аллогенной трансплантации: 100 CD150 ⁺ CD34 ^– CD34 ^{– Мышей CD45.2 размножали в течение 28 дней перед трансплантацией некондиционированным иммунодефицитным реципиентам NOD/SCID.}

(b) 4-недельный донорский PB-химеризм 100 свежих HSC (n=5) или 28-дневная культура HSC, полученная из 100 HSCs (n=5), трансплантированных, как описано в ( и ). Каждый столбец представляет отдельную мышь. ND означает не обнаружено.

(c) Примеры проточных цитометрических графиков, отображающих Т-клеточные (CD4/CD8) и В-клеточные (CD45RA, также известные как B220) линии PB у некондиционированных мышей NOD/SCID через 16 недель после трансплантации (представитель 5 мышей). ), как описано в ( a ).

Таблица расширенных данных 1:

Список антител

Таблица антимышиных антител, использованных в этом исследовании, включая поставщика и идентификатор.

Кат. № 9086 eBioscience -5931-8299) 47-0452-82

Antibody	Source	Identifier
Biotin anti-CD4	eBioscience	Cat# 13-0041-85
Biotin anti-CD8	eBioscience	Cat# 13-0081-86
Biotin anti-CD45RA/B220	eBioscience	Cat# 36-0452-85
Biotin anti-TER-119	eBioscience	Cat# 13-5921-85
Biotin anti-Ly-6G/Ly-6C (RB6-8C5)	eBioscience	Cat# 13-5931-85
Biotin anti-CD 127 (A7R34)	eBioscience	CAT# 13-1271-85
APC Anti-C-KIT (2B8)	EBIOSCIENCE	CAT# 17-1171-83
661-83
66666. 83
6666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666.	9666 (2-й. Biolegend	Кат. № 105814
FITC анти-CD34 (RAM34)	eBioscience	Cat# 11-0341-85
PE-Cy7 anti-CD 150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	Cat# 115914
PE anti-Ly-6A/E (Sca- 1) (D7)	Biolegend	CAT# 122508
PE Anti-Ly-6A/E (SCA-1) (D7)	EBIOSCIENC анти-Ly-6A/E (Sca-1) (D7)	Биолегенда	Кат. № 108105
Стрептавидин-APC/ePluor 780	eBioscience	Cat# 47-4317-82
PE-Cy7 anti-CD45.1	BioLegend	Cat# 110730
BrilliantViolet421 anti-CD45.2 (104)	BioLegend	Cat# 109832
Epluor450 Anti-CD45,2 (104)	EBIOSCIENCE	CAT# 48-0454-82
FITC ANTI-lyly-6.	6666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666.	Кат. № 11-5931-85
FITC anti-CD lib (Ml/70)	eBioscience	Кат. № 11-0112-41
PE анти-Ly-6G/Ly-6C (RB6-7C5)
PE Anti-CDLLB (ML/70)	EBIOSCIENCE	CAT# 12-0112-82
APC-EPLUOR7807
6666667. SINIORS
66 (
666 (
APC анти-CD4 (RM4-5)	eBioscience	Кат. № 17-0042-83
APC Anti-CD8 (53-6,7)	EBIOSCIENC
PE-CY7 Anti-Ly-6G/LY-6C (RB6-8C5)	EBIOSCIENCE	CAT# 25-5931-82
FITC ANTIM-CD 127 (A774)
FITC ANTIM-CD 127 (A774)
ANTIPC ANTICLC 127 (A774)
ANTIPC ANTER (A774)
(A774). # 11-1271-85
PE anti-FceRl (MAR-1)	eBioscience	Cat# 12-5898-81
BrilliantViolet421 anti-CD135 (A2F10)	Biolegend	Cat# 135353
PE anti-CDlla (M17/4)	eBioscience	Cat# 12- 0111-081
APC anti-CD201 (eBiol560)	eBiosciences	Cat# 17-2012-82
Pacific Blue anti-CD48 (BCM1)	Biolegend	Cat# 103418
APC против ESAM (1G8/ESAM)	Biolegend	Кат. № 136207

Открыть в отдельном окне

1

Нажмите здесь для просмотра. ^{(74K, pdf)}

Мы благодарим S. Takaki, Y. Ishii, H. Hasegawa, M. Hayashi, Стэнфордский центр мониторинга иммунитета человека за техническую поддержку и J. Bhadury за совет. Это исследование финансировалось грантом JSPS KAKENHI для научных исследований (JP18H05095; JP17H05086), Японским агентством медицинских исследований и разработок (JP18bm0404025), CIRM (LA1_C12–069).17; DISC1–10555), NIH (R01DK116944; R01HL147124) и Фонд Людвига. ACW финансировался Bloodwise (15050), Обществом лейкемии и лимфомы (3385–19) и JSPS. KML был поддержан Премией директора Национального института здравоохранения за раннюю независимость (DP5OD024558), Институтом стволовых клеток Сибеля, Фондом Бакстера и стипендиатом Энтони ДиДженова.

Конфликт интересов: Х. Н. является соучредителем и акционером ReproCELL. Inc.

Доступность данных:

Все графические наборы данных можно найти в Дополнительные файлы исходных данных . Дополнительные файлы данных будут доступны по обоснованному запросу соответствующих авторов.

Дополнительная информация: 5 рисунков с расширенными данными и 1 таблица с расширенными данными доступны в онлайн-версии документа.

1. Осава М., Ханада К., Хамада Х., Накаучи Х. Долгосрочное восстановление лимфогематопоэза с помощью одной гемопоэтической стволовой клетки с низким уровнем CD34/отрицательной. Наука 1996;273(5272):242–245. [PubMed] [Академия Google]

2. Копелан Э.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. N Engl J Med 2006;354(17):1813–1826. [PubMed] [Google Scholar]

3. Моррисон С.Дж., Скадден Д.Т. Ниша костного мозга для гемопоэтических стволовых клеток. Природа 2014;505(7483):327–334. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

4. Boulais PE, Frenette PS. Осмысление ниш гемопоэтических стволовых клеток. Кровь 2015;125(17):2621–2629. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

5. Yamazaki S, Ema H, Karlsson G, et al. Немиелинизирующие шванновские клетки поддерживают гибернацию гемопоэтических стволовых клеток в нише костного мозга. Клетка 2011;147(5):1146–1158. [PubMed] [Академия Google]

6. Кумар С., Гейгер Х. Биология ниши HSC и расширение HSC Ex Vivo. Тренды Мол Мед 2017;23(9):799–819. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

7. Eaves CJ. Гемопоэтические стволовые клетки: концепции, определения и новая реальность. Кровь 2015;125(17):2605–2613. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

8. Ieyasu A, Ishida R, Kimura T, et al. Полностью рекомбинантная система культивирования на основе белков специально идентифицирует факторы поддержания гемопоэтических стволовых клеток. Отчеты о стволовых клетках 2017;8(3):500–508. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

9. Куту Д.Л., Коккалиарис К.Д., Кунц Л., Шредер Т. Трехмерная карта некроветворных клеток и молекул кости и костного мозга. Нат Биотехнолог 2017;35(12):1202–1210. [PubMed] [Google Scholar]

10. Gekas C, Graf T. Экспрессия CD41 маркирует миелоидные гемопоэтические стволовые клетки взрослых и увеличивается с возрастом. Кровь 2013;121(22):4463–4472. [PubMed] [Google Scholar]

11. Umemoto T, Yamato M, Ishihara J, et al. Интегрин-αvβ3 регулирует опосредованное тромбопоэтином поддержание гемопоэтических стволовых клеток. Кровь 2012;119(1): 83–94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

12. Csaszar E, Kirouac DC, Yu M, et al. Быстрое размножение гемопоэтических стволовых клеток человека за счет автоматического контроля ингибирующей обратной связи. Клеточная стволовая клетка 2012;10(2):218–229. [PubMed] [Google Scholar]

13. Кавасаки Т., Каваи Т. Сигнальные пути толл-подобных рецепторов. Фронт Иммунол 2014;5:461. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

14. Netea MG, Van der Graaf C, Van der Meer JW, Kullberg BJ. Распознавание грибковых возбудителей Toll-подобными рецепторами. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004;23(9): 672–676. [PubMed] [Google Scholar]

15. Лурес Ф.В., Пина А., Фелонато М., Араужо Э.Ф., Лейте К.Р., Калич В.Л. Передача сигналов Toll-подобного рецептора 4 приводит к тяжелой грибковой инфекции, связанной с усилением провоспалительного иммунитета и нарушением экспансии регуляторных Т-клеток. Заразить иммунитет 2010;78(3):1078–1088. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]

16. Wilkinson AC, Morita M, Nakauchi H, Yamazaki S. Истощение аминокислот с разветвленной цепью приводит к состоянию костного мозга для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, что позволяет избежать токсичности, связанной с дисбалансом аминокислот. Опыт Гематол 2018;63:12–16. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

17. Taya Y, Ota Y, Wilkinson AC, et al. Истощение диетического валина делает возможной немиелоабляционную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток мыши. Наука 2016;354(6316):1152–1155. [PubMed] [Google Scholar]

18. Эрнандес-Сегура А., Неме Дж., Демария М. Признаки клеточного старения. Тенденции Cell Biol 2018;28(6):436–453. [PubMed] [Google Scholar]

19. де Хаан Г., Лазар С.С. Старение гемопоэтических стволовых клеток. Кровь 2018;131(5):479–487. [PubMed] [Google Scholar]

20. Flach J, Bakker ST, Mohrin M, et al. Репликационный стресс является мощным фактором функционального снижения стареющих гемопоэтических стволовых клеток. Природа 2014;512(7513):198–202. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

21. Kane MT, Bavister BD. Безбелковая культуральная среда, содержащая поливиниловый спирт, витамины и аминокислоты, поддерживает развитие восьмиклеточных эмбрионов хомяков до вылупления бластоцист. дж опыт зоопарк 1988;247(2):183–187. [PubMed] [Google Scholar]

22. Wiles MV, Johansson BM. Развитие эмбриональных стволовых клеток в химически определенной среде. Разрешение ячейки опыта 1999;247(1):241–248. [PubMed] [Google Scholar]

23. Hu Y, Smyth GK. ELDA: анализ предельного разведения для сравнения истощенных и обогащенных популяций в стволовых клетках и других анализах. J Иммунол Методы 2009 г.;347(1–2):70–78. [PubMed] [Google Scholar]

24. Yamamoto R, Morita Y, Ooehara J, et al. Клональный анализ выявляет самообновляющиеся предшественники с ограниченным клоном, генерируемые непосредственно из гемопоэтических стволовых клеток. Клетка 2013;154(5):1112–1126. [PubMed] [Google Scholar]

25. Yamamoto R, Wilkinson AC, Ooehara J, et al. Крупномасштабный клональный анализ разрешает проблему старения гемопоэтических стволовых клеток мыши. Клеточная стволовая клетка 2018;22(4):600–607.e604. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

26. Бхаттачарья Д., Росси Д., Брайдер Д., Вайсман И.Л. Приживление очищенных гемопоэтических стволовых клеток в редких нишах корректирует тяжелую лимфоидную недостаточность без кондиционирования хозяина. J Эксперт Мед 2006;203(1):73–85. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

27. Shimoto M, Sugiyama T, Nagasawa T. Многочисленные ниши для гемопоэтических стволовых клеток остаются пустыми во время гомеостаза. Кровь 2017;129(15):2124–2131. [PubMed] [Google Scholar]

28. Seita J, Ema H, Ooehara J, et al. Lnk отрицательно регулирует самообновление гемопоэтических стволовых клеток путем модификации опосредованной тромбопоэтином передачи сигнала. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(7):2349–2354. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Top Termite Control рядом со мной в Эрнакуламе – Best Termite Control рядом со мной в Эрнакуламе – Страница 1

Premium Plus

• Нам доверяют пользователи
• Подлинный список

У PCCS India более 13+ лет опыта и 1000 счастливых клиентов . У нас есть обученные и опытные специалисты. PCCS India имеет эффективные методы обработки для удаления таких вредителей, как термиты, грызуны, тараканы, муравьи и т. д. С помощью нашего специализированного геля и химической обработки. PCCS является одной из ведущих компаний по борьбе с вредителями и уборке… в Эрнакуламе. Команда PCCS имеет более чем 13-летний опыт работы и преуспела в расширении списка более чем 1000 довольных клиентов по всей Индии. Наша цель – предоставить вам услуги самого высокого качества (борьба с термитами и борьба с обычными вредителями) по наиболее конкурентоспособной цене. Наши BDO и техники имеют высокую квалификацию и прошли достаточную подготовку в соответствующей области. Наша специальность включает в себя частые посещения объекта и надлежащую отчетность соответствующему ответственному офицеру. В основном мы придаем значение Custom+ More

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получить указание на направление

премия

• 9000.1000 9000. 9000. 9000. 9000.1000 9000. 9000.1000 9000.1000 9000.1000 9000. 9000.1000 9000. 9000.1000 9000. 9000.1000 9000. 9000.1000 9000. 9000.1001111111111111111111111111111111111111109
  1111111111111111111101110 гг. Услуги по борьбе с вредителями, Борьба с вредителями в жилых помещениях, Коммерческая служба борьбы с вредителями, Услуги по борьбе с вредителями, муравьи, борьба с термитами, Служба борьбы с вредителями в домашних условиях, Борьба с вредителями, услуги по борьбе с вредителями, таракан, Службы по борьбе с вредителями, Офисы, Борьба с вредителями Roden, услуги по борьбе с вредителями Гостиница, Пест продавцы средств контроля, Борьба с вредителями в сельском хозяйстве, Служба борьбы с вредителями в жилых помещениях, Общая борьба с вредителями. + Еще

  ---

  Share

  • Share
  • Tweet
  • Pin it

  Get Direction View Details

  Premium

  • Trusted by users
  • Genuine listing

  Termites are particularly troublesome pests поскольку они могут нанести серьезный ущерб вашему дому или рабочему месту. Самостоятельные средства от термитов, такие как спрей от термитов, могут не справиться с заражением термитами на корневом уровне, особенно в случае больших колоний термитов. Получение средств от термитов у эксперта по борьбе с вредителями — это лучший способ удалить термитов с вашей собственности и защитить ваши драгоценные вещи. Летающие термиты в доме или выходящие из фундамента стены указывают на заражение термитами, которое требует немедленного лечения. Другими признаками заражения являются грязевые трубки на стенах, дупла в деревянных изделиях, поврежденная древесина/деревянная мебель и выброшенные крылья термитов. мы также рекомендуем регулярно следить за вашей собственностью и окрестностями, чтобы держать их в неблагоприятных условиях для заражения термитами. С+ Еще

  ---

  Share

  • Share
  • Tweet
  • Pin it

  Get Direction View Details

  Premium

  • Trusted by users
  • Genuine listing

  Pest control specialists with range услуг и решения нашей проблемы. Мы предоставляем ответственные и эффективные услуги с нашими опытными техническими специалистами. Счастливые и довольные клиенты. Adams Care Services, лучшая история лечения и счастливые клиенты по всей Керале. Безопасный и сертифицированный. Гарантированный сервис. Борьба с вредителями … Профессионалы+ Еще

  ---

  Share

  • Share
  • Tweet
  • Pin it

  Get Direction View Details

  Premium

  • Trusted by users
  • Genuine listing

  Over the course of its путешествие, этот бизнес прочно закрепился в своей отрасли. Вера в то, что удовлетворенность клиентов так же важна, как и их продукты и услуги, помогла этому заведению собрать обширную клиентскую базу, которая продолжает расти с каждым днем. В этом бизнесе работают люди, которые преданы своим обязанностям и прилагают много усилий для достижения общего видения и более крупных целей компании. В ближайшем будущем этот бизнес намерен расширить линейку продуктов и услуг и обслуживать более широкую клиентскую базу. Качественное решение для борьбы с вредителями в Качерипади, Эрнакулам Предоставляет лучшие услуги по борьбе с вредителями в Эрнакуламе.+ Еще

  ---

  Share

  • Share
  • Tweet
  • Pin it

  Get Direction View Details

  Premium

  • Trusted by users
  • Genuine listing

  PCS HI-CARE specialises в комплексной борьбе с вредителями. Мы предоставляем технические консультации широкому кругу коммерческих клиентов, включая, помимо прочего, производителей продуктов питания, гостиниц и индустрии развлечений, застройщиков, фирм по управлению объектами, строительных подрядчиков и консультантов. Мы предоставляем такие услуги, как общая борьба с вредителями, борьба с тараканами, борьба с термитами, борьба с мухами, борьба с грызунами и т. д. * БЕСПЛАТНО (Контроль грызунов) * ROACH OUT (Борьба с тараканами) * FLYAWAY (управление полетом) * ANTSTOPPER (управление муравьями) * BUXNETTER (постельный клоп) * УХОД ЗА ТЕРМИТАМИ (контроль термитов) * ПОСЛЕСТРОИТЕЛЬНЫЙ ТЕРМИТНЫЙ КОНТРОЛЬ * ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ ТЕРМИТОВ+ Подробнее

  ---

  Share

  • Share
  • Tweet
  • Pin it

  Get Direction View Details

  Premium

  • Trusted by users
  • Genuine listing

  Pestban Pest Control Services is один из новых инновационных поставщиков коммерческих услуг. Pestban Pest Control Services обеспечивает более высокий уровень профессионализма в отрасли борьбы с вредителями благодаря своей опытной в отрасли сервисной группе. Компания вышла на рынок, чтобы предоставлять необходимые услуги по упреждающему уничтожению вредителей, санитарию окружающей среды и техническое обслуживание жилых, коммерческих, промышленных клиенты. Pestban Pest Control Services — это растущая компания, в которой работают опытные специалисты по борьбе с вредителями. Мы надеемся способствовать лучшему пониманию коммерческой структурной и пищевой безопасности; экологическая санитария, техническое обслуживание и ведение хозяйства; и здоровье и благополучие всех в коммерческих городских и пригородных нарядах. Это обязательство дойдет до местных сообществ через + Еще

  ---

  Share

  • Share
  • Tweet
  • PIN IT

  5 Получить указание на направление

  премия

• DALVERIND

.VERINGIND 9000 9000 9000.VERINGIND.10111111111111111111111110 гг. желание быть известным как поставщик услуг, так и поставщик решений. Он стремится предоставлять клиентам комплексные решения высокой степени, которые включают как традиционные, так и экологические методы, а также информируют их о превентивных аспектах борьбы с вредителями. APCO считает, что влияние, которое мы все оказываем на окружающую среду, не следует воспринимать легкомысленно. В APCO мы серьезно относимся к этому и стремимся оказывать услуги с наименьшими последствиями при каждом столкновении с вредителями. APCO обеспечивает действительно беспроблемный опыт. Наши услуги включают в себя традиционные, экологически чистые решения, а также решения, не содержащие пестицидов, и благодаря нашему продуманному подходу у нас действительно есть что-то для каждого. Управляется командой профессионалов Стремление обеспечить высокую степень интегрированных решений Ознакомиться с профилактическими аспектами борьбы с вредителями+ Еще

---

Акция

• Акция
• Твит
• ПИН

Получить детали. убедитесь, что вы и ваша семья в безопасности. Департамент здравоохранения зарегистрировал 102 619 случаев лихорадки денге с начала 2022 года. Общее число смертей от денге составляет 268 человек. Если вы ищете способы защитить себя и своих близких от этих переносчиков лихорадки денге, мы рекомендуем вам рассмотреть наше средство от комаров. В этой обработке используются три метода выбора для уничтожения комаров: распыление внутри и снаружи помещений, термическое распыление и ларвицид. Мы считаем, что каждый дом заслуживает защиты от комаров и других вредителей. Мы знаем, как важно защитить своих близких от любых болезнетворных насекомых, а также от таких болезней, как лихорадка денге и чикунгунья, которые могут привести к тяжелым заболеваниям у детей или e+ Подробнее

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

. контрольный раствор. Компания Fumitech разработала стандартные операционные процедуры (СОП) для каждого жилого и коммерческого объекта. Вредители в доме могут нанести ущерб имуществу и вызвать проблемы со здоровьем в вашей семье. Мы можем устранить любую проблему с вредителями, которая может у вас возникнуть, а также посоветовать, что вы можете делать по дому, чтобы предотвратить заражение в будущем. безопасность вашей семьи и домашних животных. Работаете ли вы в сфере здравоохранения, гостиничного бизнеса, фармацевтики, пищевой промышленности и упаковки, путешествий, хранения и складирования; среда, свободная от вредителей, является абсолютной необходимостью. Мы не только в авангарде Integrat+ Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получить указание направления

. Эрнакулам. За время своего существования этот бизнес прочно закрепился в своей отрасли. Вера в то, что удовлетворенность клиентов так же важна, как и их продукты и услуги, помогла этому заведению … собрать обширную базу клиентов, которая продолжает расти с каждым днем. В этом бизнесе работают люди, которые преданы своим ролям и прилагают много усилий для достижения общего видения и более крупных целей компании. В ближайшем будущем этот бизнес стремится расширить линейку продуктов и услуг и обслуживать большую клиентскую базу. Персонал в этом заведении вежлив и готов оказать любую помощь. Они с готовностью ответят на любые вопросы или вопросы, которые вы м+ Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получите указание направления

. Target, средство от комаров Green Plus

---

Поделиться

• Поделиться
• Твитнуть
• Прикрепить

Получить направление Посмотреть подробности

Услуги по борьбе с вредителями Грызуны, Услуги по борьбе с вредителями, Борьба с вредителями в жилых помещениях, Коммерческая служба по борьбе с вредителями, Услуги по борьбе с вредителями муравьи, термиты Борьба с вредителями, Бытовая служба по борьбе с вредителями, Борьба с вредителями, услуги по борьбе с вредителями таракан , Услуги по борьбе с вредителями Офисы, Борьба с вредителями Roden, Услуги по борьбе с…0011

---

Акция

• Акция
• Твит
• PIN IT

Получите информацию о просмотре направления

. Наша компания освоила искусство в предоставлении услуг по борьбе с наругами в Kerala & Tamil. Борьбу с вредителями выполняют наши специалисты, обладающие всеми необходимыми знаниями и навыками в этой отрасли. Эта услуга специально предоставляется с помощью первоклассных химикатов и современных технологий в соответствии с установленными промышленными нормами. Мы предоставляем свои услуги по дезинсекции в кохине и прилегающих помещениях. Блохи. Клещи. Серебряная рыбка. Тараканы. Пчелы. Муравьи. Мыши. Крысы. Домашние вредители могут быть чем-то большим, чем просто неприятностью – они могут стать угрозой для вашего имущества и, возможно, для вашего здоровья. Фактически, одна домашняя мышь может заразить в десять раз больше пищи, чем съест. Вот почему борьба с вредителями и насекомыми так важна в вашем доме. Узнайте, как борьба с вредителями от ECO PEST INDIA может помочь решить ваши проблемы с вредителями n+ Подробнее

---

Share

• Share
• Tweet
• Pin it

Get Direction View Details

We have a state-of-the-art facilities and a team of expert professionals, which enables нам предоставлять все наши услуги в соответствии с требованиями и требованиями наших клиентов. Во время выполнения наша команда учитывает точный бюджет наших престижных клиентов, чтобы достичь их максимального уровня удовлетворения. Эти услуги … реализуются высококвалифицированными и способными сотрудниками, которые хорошо осведомлены об установленных отраслевых принципах, которые помогают оказывать эти услуги квалифицированным образом. Эти услуги пользуются большим спросом у наших клиентов благодаря своевременному выполнению и доступным ценам. Оказывая услуги, мы заботимся о том, чтобы клиенты всегда были удовлетворены нами и соответствовали потребностям клиентов. Услуги выполняются по современным методикам + Подробнее

---

Акция

• Акция
• Твит
• PIN IT

Получите детали зрения

Мы являемся опытными экспертами по борьбе с песками. Мы предоставляем отличные услуги по борьбе с термитами и другим проблемам, связанным с почтой.0004

Получить направление Посмотреть подробности

Eco Pest India, в настоящее время являющаяся подразделением Aindhriya Private Limited, базируется в Керале и начала свою деятельность в 2013 году. Мы предлагаем широкий спектр услуг по борьбе с вредителями в самых быстрых, дешевых и безопасных возможный способ. МИССИЯ Наша миссия состоит в том, чтобы быть одним из самых уважаемых поставщиков услуг и увеличить долю рынка, лояльность клиентов, добиться улучшения работы и системы, удовлетворенности клиентов и уменьшить жалобы на долгосрочный рост. ОПЫТ Мы являемся признанной компанией вместе с нашей динамичной командой хорошо обученных, преданных своему делу профессиональных и сертифицированных сотрудников для предоставления высококачественных услуг. МЕТОДЫ ОБУЧЕНИЯ У нас есть информативные методы обучения, которые включают видео, рабочие тетради, которые помогают нашим сотрудникам работать более эффективно. Мы стремимся постоянно совершенствоваться и создавать инновационные идеи.+ Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получите режиссер. Управление термитами, контроль муравьи, управление грызунами, контроль Cocroach . .

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получите Управление.1215

WE ARE предлагает широкий спектр высококачественных, экологически чистых и индивидуальных коммерческих и товарных услуг по борьбе с вредителями, Pan India. Наша команда технических экспертов гарантирует, что вы получите наиболее подходящее и практичное, экологически безопасное решение для борьбы с вредителями, которое призвано устранить ваши риски, связанные с вредителями. … Эта служба борьбы с вредителями очень эффективна и проста. Сила службы борьбы с вредителями: • Квалифицированный и опытный персонал • Услуги, соответствующие стандарту качества и питания • Индивидуальные решения • Руководство по профилактическим мерам • Общенациональная сервисная сеть. О нас Наши услуги включают обработку от обычных вредителей, таких как муравьи, мухи, тараканы, гекконы (ящерицы), комары, грызуны, чешуйницы, пауки, насекомые, термиты, сорняки и жуки-древоточцы. + Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получите указание направления

Контроль PEST KOCHI основан на Kerala, и начались в 2013 году. услуги по борьбе с вредителями самым быстрым, дешевым и безопасным способом. МИССИЯ Наша миссия состоит в том, чтобы быть одним из самых уважаемых поставщиков услуг и увеличить долю рынка, лояльность клиентов, добиться улучшения работы и системы, удовлетворенности клиентов и уменьшить жалобы на долгосрочный рост. ОПЫТ Мы являемся признанной компанией вместе с нашей динамичной командой хорошо обученных, преданных своему делу профессиональных и сертифицированных сотрудников для предоставления высококачественных услуг. МЕТОДЫ ОБУЧЕНИЯ У нас есть информативные методы обучения, которые включают видео, рабочие тетради, которые помогают нашим сотрудникам работать более эффективно. Мы стремимся постоянно совершенствоваться и создавать инновационные идеи.+ Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получите указание направления

Pest Kochi. услуг по борьбе с вредителями самым быстрым, дешевым и безопасным способом. МИССИЯ Наша миссия состоит в том, чтобы быть одним из самых уважаемых поставщиков услуг и увеличить долю рынка, лояльность клиентов, добиться улучшения работы и системы, удовлетворенности клиентов и уменьшить жалобы на долгосрочный рост. ОПЫТ Мы являемся признанной компанией вместе с нашей динамичной командой хорошо обученных, преданных своему делу профессиональных и сертифицированных сотрудников для предоставления высококачественных услуг. МЕТОДЫ ОБУЧЕНИЯ У нас есть информативные методы обучения, которые включают видео, рабочие тетради, которые помогают нашим сотрудникам работать более эффективно. Мы стремимся постоянно совершенствоваться и создавать инновационные идеи.+ Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получить детали просмотра направления

УСПРАВЛЕНИЕ ПЛАГОСКИ Борьба с мухами Борьба с ящерицами Борьба с древоточцами Борьба с комарами И все другие общие услуги по борьбе с вредителями и уборке Наши услуги доступны по всей Керале Мы предоставляем 7 лет гарантии

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получить детали для просмотра направления

Мы предоставляем сервис по борьбе с устными терминами, коктач, Rodcator .

---

Поделиться

• Поделиться
• Твитнуть
• Закрепить

Получите подробности просмотра направления

Полные решения для борьбы с вредителями

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

. безопасный для человека химикат. Химикат нового поколения без запаха и ISI, одобренный ВОЗ химикат. Качество технических специалистов: все специалисты по обслуживанию должным образом обучены и имеют многолетний опыт работы. Наши услуги: наше качество и надежность обязывают нас предоставлять такую ​​же ценность… нашим клиентам, чтобы не только сохранить имидж нашего бренда, но и усилить его, предоставляя нашим клиентам дополнительные услуги с добавленной стоимостью.+ Еще

---

Share

• Share
• Tweet
• PIN IT

Получить режиссуру. – качественные, эффективные академические навыки, предоставление дополнительного обучения по конкретному содержанию и установление связи с учебным заведением. Репетиторы должны сочетать свои знания по содержанию с сочувствием, честностью, трудолюбием, скромностью и юмором. Репетитор должен иметь страсть к процессу преподавания и обучения. Цель репетитора состоит в том, чтобы помочь учащимся НАУЧИТЬСЯ помогать себе, а также помогать или направлять учащихся к тому моменту, когда они станут самостоятельными учениками.

• Репетиторство доступно для любого студента JSU по большинству основных курсов
• Обучение БЕСПЛАТНО, пока вы являетесь студентом JSU
• Учащимся необходимо записаться на очное или виртуальное занятие с помощью JSU Navigate .
  • Личные встречи будут проходить в Центре успеха студентов, расположенном в библиотеке Хьюстона Коула, 2-й этаж (256-782-8223)   
  • Виртуальное обучение доступно на сайте tutor.com (дополнительную информацию см. ниже)

Как записаться на репетиторство

Пошаговые инструкции

1. Войдите в свою учетную запись MyJSU и найдите раздел «Студенческие ссылки» на своей домашней странице.
2. Выберите ссылку «JSU Navigate» . Вы войдете в свой профиль JSU Navigate.
3. На главном экране учащегося Изменить термин . Нажмите на раскрывающееся меню, расположенное в правом верхнем углу экрана рядом с увеличительным стеклом. Выберите текущий срок (например, весна 2021 г.) .
4. Нажмите синюю кнопку «Записаться на прием» , расположенную непосредственно под логотипом JSU.
5. Какой тип встречи вы хотели бы назначить? В раскрывающемся меню нажмите Репетиторство .
6. Выберите категорию услуги . Каждая категория предлагает различные услуги, доступные в Репетиторстве
   

   Варианты категорий услуг	Услуги, доступные в категории услуг
   Репетиторство	Личное обучение, виртуальное обучение
   Академическая помощь	Академическая успеваемость, Коучинг успеха
   Прочие услуги	Использование компьютера, использование компьютера Honorlock, печать
   Дополнительная инструкция (SI)	Часы работы руководителя СИ

7. Выберите услугу для записи на прием. Службы появятся в раскрывающемся меню в зависимости от выбранной вами категории службы.
8. Выберите место (например, Центр успеха студентов, 2-й этаж) и сотрудника , затем нажмите «Далее». Если у вас нет предпочтений по персоналу, вы можете использовать «Любой персонал».
9. Выберите день и время , на которое вы хотите записаться (доступное время будет выделено синим цветом). Нажмите «Далее».
10. Пересмотрите свою встречу. У вас есть возможность получать электронные и текстовые напоминания на себя и обновлять номер своего мобильного телефона. Не забудьте прочитать Дополнительные сведения, чтобы получить важную информацию о назначенном приеме. Когда вы закончите просмотр, нажмите «Подтвердить встречу».

Видеоруководство

Расписание занятий Центра успеха студентов

Осень 2022

Что такое репетиторство?

Репетиторство — это больше, чем просто помощь ученику с домашним заданием. Репетиторство — это услуга, которая в конечном итоге помогает учащимся стать независимыми и активными учениками. Как репетитор, вы помогаете учащимся развивать навыки, которые помогут им учиться самостоятельно, чтобы они могли добиться академического успеха. Ваша обязанность состоит в том, чтобы привести ученика к его собственному пониманию.

Студенческие ожидания

• Учащиеся должны посещать уроки репетиторства, подготовленные с помощью книг, заметок, домашних заданий, вопросов, расходных материалов, учебных планов, прошлых тестов и т. д.
• Учащиеся должны как можно конкретнее рассказать о том, чего они надеются достичь во время занятия с репетитором. Задавайте вопросы и слушайте предложения.
• Учащиеся должны выполнить домашнюю работу самостоятельно, прежде чем приносить ее репетитору  в помощь; репетитор  не может выполнить домашнее задание за учащихся.
• Учащиеся должны понимать, что репетиторы не обязаны выполнять домашние задания или повторять содержание курса во время занятий с репетиторами.
• Студенты должны уважительно относиться ко всем преподавателям, студентам и объектам SSC.
• Студенты должны быть активными участниками во время занятий.

Ожидания репетитора

• Будьте пунктуальны, оказывайте поддержку и будьте профессиональны 
• Отвечайте на вопросы в меру своих возможностей
• Работа со студентами, а не для студентов
• Быть осведомленным о других доступных ресурсах кампуса, которые могут помочь студентам
• Установите четкие ожидания от занятия и поощряйте студентов к самостоятельному обучению
• Предлагайте позитивный настрой и проявляйте уважение к различным точкам зрения и стилям обучения
• Репетиторы НЕ исправляют ваши домашние задания, проекты или домашние экзамены. Они предоставят полезные комментарии и предложения, которые помогут способствовать самостоятельному обучению.
• Репетиторы НЕ пытаются предсказать, какую оценку получит учащийся за задание, и не могут говорить за преподавателя. Учащиеся должны обращаться к своим преподавателям за любыми разъяснениями по заданию/оценке.

Tutor.com (онлайн-репетиторство)

Поддержка онлайн-обучения предоставляется tutor.com и Центром письма.

Центр успеха студентов рад объявить о партнерстве с tutor.com, чтобы каждый семестр предоставлять студентам онлайн-поддержку в обучении. Tutor.com предоставляет студентам доступ к более чем 3000 онлайн-репетиторов и возможность записи на прием 24 часа в сутки, 7 дней в неделю. Предметы охватывают широкий спектр типов курсов, включая математику, естественные науки, мировые языки, информатику, сестринское дело и медицинские науки, историю и социальные науки, литературу и бизнес. Поддержка письма будет по-прежнему предлагаться Центром письма JSU.

Для доступа к tutor.com:

• Войти в Canvas
• Выберите ссылку tutor.com в меню навигации вашего курса
• Создайте или войдите на tutor.com и выберите «Подключиться к репетитору»

Для получения дополнительной информации посетите сайт www.tutor.com/higher-education. Чтобы получить доступ к tutor.com, учащиеся должны войти в Canvas или написать Канди Момон, координатору репетиторов, по адресу [email protected].

Преподаватели, которые хотят узнать больше о функциях tutor.com и о том, как tutor.com может помочь улучшить результаты обучения учащихся, не стесняйтесь обращаться к Канди Момон по адресу [email protected] или посетить центр обслуживания клиентов на сайте www.tutor. com/clientcareHEd.

Если у студента нет доступа к tutor.com, пожалуйста, напишите Дебре Джеймс, директору по академической поддержке и успеху, по адресу [email protected]. Потребуются CRN курса и номер раздела.

Цели обучения

• Помочь учащимся стать независимыми учениками
• Чтобы определить проблемную область (области) учащегося
• Чтобы помочь учащимся развить академическое поведение и учебные навыки
• Чтобы помочь учащимся достичь более высокого уровня компетентности в предметной области
• Чтобы помочь учащимся стать активными в процессе обучения
• Определить предпочтительные стили обучения учащихся и реализовать соответствующие стратегии обучения
• Открыто и четко сообщать о любых опасениях по поводу того, как проводятся занятия с репетиторами

Хотите стать репетитором?

• Требуемый минимальный средний балл колледжа 3. 0
• Должен получить оценку A или B по курсам, которые вы хотите преподавать
• Должен закончить хотя бы один очный семестр в JSU
• Необходимо пройти как минимум 3 кредитных часа в JSU за осенний или весенний семестр
• Кандидаты должны приложить к онлайн-заявке неофициальную копию транскрипта учащегося или регистрации в классе в качестве доказательства зачисления
• Должен быть готов преподавать в вечерние часы и во время, которое не противоречит расписанию занятий
• Необходимо представить форму рекомендации преподавателей.

Отмены назначений репетитора

Преподаватели Центра успеха студентов должны предоставить форму отсутствия студенческого персонала, чтобы запросить одобрение у координатора репетиторов. Отсутствие не будет подтверждено до тех пор, пока форма не будет обработана и репетитор не получит подтверждающий ответ. Если у репетиторов есть вопросы или опасения по поводу этого процесса, они могут связаться с Канди Момон, координатором репетиторов, по адресу cburtonmomon@jsu. edu или по телефону 256.782.8306.

Все другие преподаватели JSU, не работающие в Центре успеха студентов, должны связаться со своими отделами, чтобы отменить встречи.

Поддержка Canvas и MyCoast | Orange Coast College

Нужна помощь?

MyCoast

Необходимо получить доступ к вашей учетной записи

• Вы забыли свой пароль? Воспользуйтесь системой единого входа прибрежных колледжей, чтобы восстановить пароль.
• Нужна помощь с вашей учетной записью MyCoast? Позвоните нам по телефону (714) 438-8111.

  

Для получения дополнительной информации

Ознакомьтесь с часто задаваемыми вопросами MyCoast ниже.

Холст

Примечание : Справка Canvas по телефону и через Интернет не обеспечивает техническую поддержку MyCoast.

Получите справку по Canvas по телефону

С 7:30 до 16:30 с понедельника по пятницу, позвоните по телефону (714) 432-6888

 

Получите справку по Canvas онлайн

Круглосуточный онлайн-чат, 7 дней в неделю, отправьте запрос на помощь форма и поиск Направляющие холста

Узнать больше

Часто задаваемые вопросы MyCoast

• Какое у меня имя пользователя и пароль?

• Сброс пароля и вход в систему

• Могу ли я получить доступ к MyCoast за пределами кампуса?

• Могу ли я переслать свою электронную почту учащегося (Gmail)?

• Почему я вижу логотип Coast или логотипы других колледжей при входе в MyCoast?

• Как узнать, когда назначено время моей регистрации?

• Как я могу проверить, не приостановлены ли мои записи/регистрации?

• Как зарегистрироваться на курсы?

• Как распечатать квитанцию ​​о программе/распечатку класса?

• Как мне проверить остаток на моем счете и/или оплатить комиссию?

• Как проверить свои оценки за семестр?

• Как я могу заказать официальную стенограмму для отправки себе или другому колледжу?

• Могу ли я получить доступ к своим онлайн-курсам через MyCoast?

• Нужно ли мне выходить из системы?

• У меня есть отказ от платы за Финансовую помощь, но система попросила меня заплатить за обучение. Что я делаю?

• Есть ли очередь на занятия в MyCoast?

• Как зарегистрироваться с помощью кода авторизации добавления?

• Как бросить класс?

• Как купить парковочную наклейку?

Условия торговли Alibaba – Ex Works – Что такое EXW

«Инкотермс» — это сокращение от «Международные коммерческие условия». Они публикуются Международной торговой палатой и используются в коммерческих сделках между импортерами и экспортерами, чтобы избежать путаницы при ведении внешней торговли. Они помогают каждой стороне понять точные условия их делового соглашения и понять, кто за что отвечает на каждом этапе сделки. Здесь мы рассматриваем Инкотермс « Ex Works », сокращенно EXW.

Что такое Инкотермс «Ex Works» (EXW)?

Из всех существующих договоренностей о доставке и логистике сделка Ex Works является самой простой для продавца. Контракт Ex Works возлагает большую часть ответственности непосредственно на покупателя.

В контракте Ex Works покупатель соглашается забрать товар на складе или фабрике производителя или продавца, а также оформить все документы, относящиеся к сделке. Эти документы включают таможенное оформление и страховку. Покупатель также несет ответственность за полную стоимость доставки и логистики.

Ответственность продавца

В обязанности продавца на условиях самовывоза входит надлежащая маркировка товаров, которые необходимо забрать после их надлежащей упаковки. Продавец также должен обеспечить безопасную доставку товара в заранее согласованный пункт выдачи, которым может быть завод продавца, склад, местный порт или другой согласованный пункт. Продавца также могут попросить помочь с получением документов, таких как экспортные лицензии, но ответственность за это может оставаться на покупателе. Независимо от этого, покупатель должен оплатить сборы за любые необходимые документы.

Ответственность покупателя

Покупатель несет основную ответственность за товары и транзит товаров на условиях франко-завод. При получении товара покупатель обязан покрыть все расходы и принять на себя риски. Это включает в себя любые повреждения или потери, которые могут быть понесены в пути. Покупатель также несет ответственность за любые транспортные или авиаперевозки. Покупателю также придется иметь дело с разгрузкой и хранением товаров после того, как они достигли его / ее порта приписки, а также с любой логистикой, необходимой для доставки товаров в конечный пункт назначения.

Привилегии продавца

Как указано выше, соглашения Ex Work предоставляют продавцу множество преимуществ. Ex Works возлагает большую часть работы и рисков на покупателя. Даже если продавец помогает покупателю, покупатель все равно несет ответственность, если что-то пойдет не так. Продавец может помочь покупателю, погрузив товар покупателя на грузовик или корабль, но не обязан этого делать.

Преимущества для покупателя

Несмотря на всю дополнительную работу и риск, покупатель может максимизировать прибыль от соглашения Ex Works. Продавцы, которые оформляют заказы за границей, часто также контролируют способ доставки покупателю. Это означает, что продавец может договориться с транспортной компанией о получении комиссии. Из-за такой договоренности транспортная компания может увеличить стоимость своих услуг. Эти увеличения всегда будут переданы покупателю. Имея дело со всеми договоренностями о доставке внутри компании, покупатель может исключить добавленную продавцом стоимость и добавить ее к своей собственной прибыли после продажи товара.

Трудности покупателя

Важно отметить, что в некоторых торговых блоках (например, ЕС) документы экспортной декларации должны быть заполнены резидентом. Если покупатель или представитель покупателя в стране получения не является резидентом страны или блока, он не сможет оформить документы, необходимые для получения товара. Всегда проверяйте это правило перед импортом.

Ex Works по сравнению с FOB и FCA

«Ex Works» — это термин Инкотерм, такой как «Free on Board» (FOB) и «Free Carrier» (FCA), которые являются методами доставки, которые могут кардинально отличаться от Ex Works.

Основное различие между Ex Works и FOB заключается в том, что на условиях FOB продавец несет ответственность за товары до тех пор, пока они не будут доставлены в указанный пункт отправления. После того, как товары достигают этой точки, покупатель берет на себя все расходы, ответственность и риски, как и в случае с франко-заводом.

Соглашение о бесплатном перевозчике (FCA) является полной противоположностью двух методов, перечисленных выше. При доставке на условиях FCA продавец несет полную ответственность за доставку товара от места происхождения до конечного покупателя. Теперь продавец берет на себя всю ответственность и риск за сохранность товара, а также за оформление всех документов, необходимых для доставки.

Заключение

Для покупателя заключение соглашения о доставке на условиях самовывоза может быть рискованным и трудоемким, что увеличивает рабочую нагрузку. Однако, если покупатель обладает достаточными знаниями, подходящей организацией и связями, он может сэкономить деньги с договоренностью Ex Works.

Для продавца соглашение Ex Works может быть хорошим выбором, так как оно избавляет продавца от большинства рисков и ответственности. Единственный минус в том, что продавец упустит свою комиссию от судоходной компании.

Длительное поддержание ex vivo тканей яичка, продуцирующих фертильную сперму, в микрофлюидном устройстве

Введение

История сперматогенеза in vitro восходит к примерно столетию назад. Это соответствует истории методов культивирования органов, поскольку сперматогенез in vitro осуществлялся в основном с использованием метода культивирования органов примерно до 1970-х годов ¹ . Хотя существует несколько способов культивирования фрагмента ткани или небольшого органа, золотым стандартом долгое время оставался так называемый интерфазный метод, при котором образцы помещаются на границе раздела культуральной среды и газового слоя ² . Мы применили этот классический метод культивирования органов для культивирования тканей семенников мышей и успешно индуцировали полный сперматогенез, от сперматогониальных стволовых клеток до формирования сперматозоидов, способных к фертильности ^3,4,5 . Тем не менее, общая эффективность и продолжительность сперматогенеза были далеки от наблюдаемых 92–216 in vivo 92–217 . В организме кровеносные капилляры, окружающие единицу ткани, снабжают питательными веществами и кислородом и эффективно и непрерывно удаляют отходы, способствуя гомеостазу регионарной ткани. Интерфазный метод, лишенный такой системы микроциркуляции, поэтому не может обеспечить условия, сравнимые с условиями in vivo .

Чтобы преодолеть это, исследователи внедрили механизмы кровообращения в свои системы культивирования. В частности, Роуз и его коллеги разработали культуральную систему, названную системой циркумфузии, в которой циркулирующая среда течет с высокой скоростью по культивируемой ткани, покрытой целлофановой мембраной ^6,7 . Сообщалось, что различные органы, культивируемые в этой системе, сохраняли свои морфологические особенности в течение длительного периода в несколько месяцев. Однако, к сожалению, в то время этот метод не был полностью оценен с точки зрения функций тканей, и до настоящего времени он редко исследовался. С другой стороны, недавно микрофлюидика (МФ) была применена в экспериментах с клеточными культурами 9.0027 8,9,10,11 . Микрочип, изготовленный из полидиметилсилоксана (PDMS) ¹² и имеющий набор микроканалов, протравленных или отформованных в нем, может служить сосудом для культивирования клеток и легко приспосабливается к потоку среды или циркуляции ¹³ . Кусочки ткани, такие как срезы мозга или печени, также культивировали в устройствах MF для поддержания их функции более благоприятно, чем традиционные методы культивирования ^14,15 . Теперь с помощью технологий MF стало возможным проверить, действительно ли эффективна эта идея включения систем кровообращения в систему культивирования для индукции и поддержания функций тканей в течение длительного периода времени. Действительно, недавно исследователям удалось продлить период культивирования тканей или клеточных агрегатов в устройствах MF на несколько недель 9 .0027 16,17 , и важность долгосрочного культивирования начинает осознаваться ¹⁸ .Благодаря нашим исследованиям с использованием технологии MF мы разработали и произвели устройства для культивирования эмбрионов, эпителиальных клеток кишечника, клеток печени и iPS-клеток. ^19,20,21,22 . Одной из особенностей этих устройств МЖ было введение пористых мембран в отдельные камеры или каналы. Такие мембранные устройства стали эффективно использоваться для клеточных культур другими исследователями ^23,24,25 . В настоящем исследовании, основываясь на таком опыте, мы разработали устройство MF, включающее пористую мембрану, которая отделяет культивируемую ткань от медленно текущей среды. Мы обнаружили, что фрагменты ткани семенников мыши, загруженные в это устройство, успешно поддерживали сперматогенез и эффективно вырабатывали тестостерон в течение длительных периодов времени.

Результаты

Ограничение классического интерфазного метода

В этом проекте для поддержания сперматогенеза in vitro в течение длительных периодов времени, первоначально была проведена повторная оценка межфазного метода или метода агарозного геля (АГ) ^3,5 . Используя трансгенных мышей Acr-Gfp , которые экспрессируют GFP в сперматогенных клетках, начиная с фазы середины мейоза (дополнительная рис. S1), степень прогрессирования сперматогенеза оценивали по степени GFP, которая классифицирует распространение экспрессии GFP в каждую ткань на 5 классов (дополнительный рис. S2A). В эксперименте с культивированием в общей сложности 73 тканей средний уровень GFP достиг пика через 4 недели со значением выше уровня 4 и постепенно снижался примерно до уровня 1 через 18 недель (дополнительный рисунок S3A). Через 24 недели экспрессия GFP наблюдалась у 9ткани (12,3%) и сперматиды были подтверждены у 4 (5,5%). Эти продолжительная экспрессия GFP и очаги сперматогенеза, подтвержденные гистологически, были неожиданными и довольно удивительными. Однако они носили спорадический характер и ограничивались небольшим участком ткани. Кроме того, в ходе наших экспериментов не удалось выявить ключевые факторы, способные индуцировать столь длительный сперматогенез. Таким образом, явление оставалось редким и неконтролируемым. Одним интересным открытием, которое отличалось при сравнении ранней экспрессии GFP и длительной экспрессии, было их расположение в ткани. Регулярная экспрессия GFP, фокус сперматогенеза, начинается на периферии каждого кусочка ткани (дополнительная рис. S3B). Эта топологическая особенность, однако, не применима к долгоживущим фокусам экспрессии GFP. Оказалось, что они находятся внутри тканей (дополнительная рис. S3C). Гистологическое исследование также показало, что семенные канальцы, несущие сперматогенез, наблюдались не на краю, а в субмаргинальной внутренней области тканей (дополнительная рис. S3C). Это наблюдение предполагает, что прямое воздействие воздуха и среды на семенные канальцы было невыгодным при попытках поддерживать сперматогенез в течение длительного периода.

Молекулярная диффузия через ткань яичка

Расстояние, на которое молекулы питательных веществ могут диффундировать через ткань яичка, было важным вопросом при разработке устройства MF. Это расстояние молекулярной диффузии было измерено с использованием прототипа МФ-устройства, изготовленного из ПДМС, названного щелевым устройством (дополнительный рисунок S4). В этом устройстве образец ткани помещали в тканевую камеру, которая была отделена от канала потока среды совмещенными столбиками и прорезями. Области в ткани яичка, которые оставались жизнеспособными, находились на расстоянии 300 ~ 400 мкм от прорезей столбов, что указывает на то, что диффузия питательных веществ может достигать такого расстояния (дополнительная рис. S5). Эксперимент с этим устройством не только дал нам данные о расстоянии диффузии, но также показал, что отделение ткани образца от проточной среды может быть лучше для тканей яичка в микрофлюидном устройстве.

Конструкция устройства MF

На основе вышеизложенной информации было разработано устройство MF (рис. 1А). В устройстве используется тонкая пористая мембрана из поликарбоната с размером пор 10 мкм для разделения тканей образца и протекающей среды. Канал потока среды (2 мм в ширину и 400 мкм в высоту) должен был служить капиллярным сосудом для непрерывной подачи свежей культуральной среды (рис. 1В, С). Размер камеры образца ткани составлял 2 мм × 3 мм × 160 мкм (Ш × Д ×D), что обеспечивает достаточную диффузию молекул через мембрану и в ткани к ее основанию. Поскольку диаметр семенных канальцев увеличивается с 50 ~ 70  мкм при рождении до примерно 200 мкм на взрослой стадии, считалось, что глубина камеры 160  мкм обеспечивает почти полное развитие канальцев в камере. В этом камерном пространстве размещалось единственное яичко новорожденных, и его рост наблюдали по уменьшению свободного пространства по мере его роста. Когда использовали семенники старых мышей, которые заполняли пространство при нагрузке, рост не был четко отмечен, но они распространялись в сторону входного канала.

Рисунок 1: Микрожидкостное устройство.

( A ) Концепция устройства заключалась в разделении потока среды и ткани с помощью пористой мембраны. ( B ) Схематическое трехмерное изображение устройства. ( C ) Изображение устройства с тканью яичка, загруженной в камеру.

Изображение полного размера

Сперматогенез в устройстве MF

Начальный эксперимент был проведен с использованием тканей семенников 0,5-дневной мыши Acr-Gfp . В этом возрасте семенные канальцы содержат только гоноциты в качестве зародышевых клеток, предшественников сперматогоний (дополнительная рис. S6). В камере каждый семенной каналец был четко виден под стереомикроскопом, и экспрессия GFP была подтверждена с 21-го по 42-й день культивирования. , когда он был обработан для гистологического исследования (рис. 2А). Вследствие плоского распределения тканей в камере и равномерного воздействия протекающей среды сперматогенез происходил в большинстве семенных канальцев. В этом образце процент канальцев, экспрессирующих GFP, составлял более 70%, что соответствует GFP-уровню 5 (дополнительная рис. S2B). Фактически, гистологическое исследование подтвердило, что 890,4% (185/207) семенных канальцев содержали зародышевые клетки в мейотической фазе, идентифицированные по их расположению в канальце и характерному внешнему виду хроматина (рис. 2А). Это была высокоэффективная и широко распространенная индукция сперматогенеза в условиях ex vivo , хотя она не сравнима со зрелым семенником in vivo , что составляет почти 100%, а каждый семенной каналец содержит 4 слоя половых клеток, в том числе в мейотической фазе во втором слое (дополнительный рис. S6). В случае метода АГ, с другой стороны, такой широко распространенной индукции сперматогенеза не происходило, потому что семенные канальцы на агарозном геле сливались, образуя куполообразную структуру, даже когда они изначально были плоскими. Таким образом, во многих случаях центральная область получала недостаточное количество питательных веществ и кислорода, что приводило к дегенеративным или некротическим изменениям ткани (рис. 2В).

Рисунок 2: Развитие сперматогенеза в микрожидкостном устройстве.